響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑豆丹貝固體發(fā)酵條件的研究

武悅，王坤，牛廣財(cái)，趙婧，朱丹

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

丹貝(tempeh)又稱天培、天貝，是源于印度尼西亞的一種大豆發(fā)酵類食品，被當(dāng)?shù)厝俗鳛橹魇场Ｋ菍⒋蠖菇?jīng)過浸泡、脫皮、蒸煮、調(diào)酸和接種少孢根霉發(fā)酵而成的具有白色菌絲的餅狀物[1,2]，因其風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉和制作簡易而備受民眾喜愛。丹貝現(xiàn)已躋身于世界高檔食品市場，且有成為全球化食品的趨勢[3]。

丹貝的生產(chǎn)一般采用自然發(fā)酵和純種發(fā)酵方法。雖然純種發(fā)酵的丹貝質(zhì)量不及天然發(fā)酵產(chǎn)品，但是它容易控制，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。因此，純種發(fā)酵方法應(yīng)用較多[4]。由于丹貝發(fā)酵是微生物生長及其產(chǎn)物形成的一系列酶促反應(yīng)過程，發(fā)酵原料(底物)、發(fā)酵時(shí)間、接種量和pH等因素都會(huì)影響少孢根霉的生長和最終發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)[5]。劉全德等以氨基氮含量為主要評價(jià)指標(biāo)，結(jié)合感官評分，確定多菌種發(fā)酵制作丹貝的前發(fā)酵工藝條件為：在蒸煮大豆基質(zhì)中加入3%的米粉，接種3%的乳酸菌，于42 ℃發(fā)酵2.5 h至pH值5.0，再加入5%的少孢根霉∶甜酒曲為3∶2的混合菌，于37 ℃下發(fā)酵18 h[6]。周思靜等以大豆為原料，少孢根霉為發(fā)酵菌株，制備高活性β-葡萄糖苷酶丹貝的發(fā)酵工藝為：蒸煮時(shí)間20 min、接種量1.50%、發(fā)酵時(shí)間36 h的條件下β-葡萄糖苷酶活性最高，為345.63 U[7]。

目前，丹貝生產(chǎn)主要以大豆為原料，但也有研究采用其他豆類或豆類副產(chǎn)物為原料制作丹貝，如蠶豆、鷹嘴豆、油菜籽餅、玉米-大豆混合物、豆渣等[8-12]。黑豆又稱烏豆、黑大豆，我國東北地區(qū)出產(chǎn)最多，黑豆中含有葉綠素和黑色素等花色苷類物質(zhì)，黑豆的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值均高于普通大豆[13]，是急需開發(fā)的黑色食品資源之一。因此，本研究以黑豆為主要原料，通過響應(yīng)曲面法對黑豆丹貝的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而得到最佳發(fā)酵條件，不僅能豐富丹貝的種類，還能為黑豆功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)，解決了黑龍江省地產(chǎn)黑豆精深加工不足的問題，也為其他原料的開發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑豆：購于黑龍江省建三江農(nóng)場；食品級乳酸：購于鄭州高研生物科技有限公司；少孢根霉(Rhizopusoligosporus)：購于南京天貝人發(fā)酵技術(shù)有限公司，孢子數(shù)量在106個(gè)/g以上。

1.2 主要儀器

電磁爐、電蒸鍋 廣東美的生活電器制造有限公司；電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DL-CJ-1N型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；L420臺式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 丹貝生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

1.3.1.1 丹貝生產(chǎn)工藝流程

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

選用顆粒飽滿的黑豆，去除劣豆，用清水洗凈，黑豆∶水為1∶3 (m/V)，室溫浸泡使其易于脫皮。浸泡時(shí)間24 h，然后將豆粒置于電蒸鍋中蒸熟蒸透，至松軟無硬芯即可。在超凈工作臺中冷卻至室溫后，添加適量的乳酸混勻，接種少孢根霉菌粉并混合均勻，裝入扎孔的發(fā)酵袋(8 cm×12 cm)中，置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 發(fā)酵時(shí)間對丹貝品質(zhì)的影響

在接種量0.25%、乳酸添加量1.0%、發(fā)酵溫度34 ℃的條件下，研究發(fā)酵時(shí)間(24，30，36，42，48 h)對丹貝品質(zhì)的影響。

1.3.2.2 發(fā)酵溫度對丹貝品質(zhì)的影響

在接種量0.25%、乳酸添加量1.0%、發(fā)酵時(shí)間30 h的條件下，研究發(fā)酵溫度(28，31，34，37，40 ℃)對丹貝品質(zhì)的影響。

1.3.2.3 少孢根霉接種量對丹貝品質(zhì)的影響

在乳酸添加量1.0%、發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間30 h的條件下，研究少孢根霉菌粉接種量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)對丹貝品質(zhì)的影響。

1.3.2.4 乳酸添加量對丹貝品質(zhì)的影響

在接種量0.25%、發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間30 h的條件下，研究乳酸添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%)對丹貝品質(zhì)的影響。

1.3.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以及Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、乳酸添加量4個(gè)因素，以感官評分為指標(biāo)，對黑豆丹貝的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 產(chǎn)品感官評定

黑豆丹貝的感官評分方法見表2。

表2 黑豆丹貝的感官評分方法Table 2 Sensory evaluation method of black soybean tempeh

1.3.4.2 其他指標(biāo)測定

氨基酸態(tài)氮：采用GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》；還原糖：采用3,5-二硝基水楊酸法；可溶性蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[14]。大腸菌群計(jì)數(shù)：采用GB 4789.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》；菌落總數(shù)：采用GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對黑豆丹貝品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間過短，菌種生長不佳，制備的丹貝質(zhì)量較差；時(shí)間過長，容易產(chǎn)生不良?xì)馕?，所以選擇合適的發(fā)酵時(shí)間至關(guān)重要。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation time on sensory score of black soybean tempeh

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，感官評分呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，丹貝表面菌絲過少，豆瓣松散，無香味；當(dāng)發(fā)酵至36 h時(shí)，豆瓣表面菌絲致密，香味醇正，無異味，此時(shí)感官評分最高，為83.6；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過42 h時(shí)，丹貝的品質(zhì)開始下降，表面有黑色孢子和不良?xì)馕懂a(chǎn)生。因此，發(fā)酵時(shí)間在30～42 h時(shí)，丹貝的品質(zhì)較好。

2.2 發(fā)酵溫度對黑豆丹貝品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對丹貝品質(zhì)的影響較大，見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score of black soybean tempeh

由圖2可知，當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，豆瓣表面菌絲過少，豆瓣松散，丹貝的品質(zhì)較差，感官評分很低；當(dāng)溫度為31～34 ℃時(shí)，黑豆丹貝的菌絲較致密，部分豆瓣松散，香味較濃；當(dāng)溫度大于37 ℃時(shí)，丹貝發(fā)酵溫度偏高，開始有少量孢子產(chǎn)生，顏色偏黃并伴有腐敗氣味。以感官為評定指標(biāo)，可得出發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)，丹貝的品質(zhì)最佳。因此，發(fā)酵溫度在31～37 ℃時(shí)，丹貝的品質(zhì)較好。

2.3 接種量對黑豆丹貝品質(zhì)的影響

接種量是影響丹貝品質(zhì)的重要因素之一，接種量過少，菌絲生長緩慢，分解蛋白質(zhì)不完全，無法形成完整、致密的糕團(tuán)狀；接種量過高，會(huì)因過度分解蛋白質(zhì)而有輕微腐敗氣味，且會(huì)產(chǎn)生孢子，從而影響產(chǎn)品的外觀和氣味。

圖3 接種量對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on sensory score of black soybean tempeh

由圖3可知，在接種量在0.20%～0.30%時(shí)，黑豆丹貝的感官評分較高。

2.4 乳酸添加量對黑豆丹貝品質(zhì)的影響

添加乳酸不僅可以為少孢根霉的生長提供適宜的環(huán)境，還可以抑制其他雜菌的生長。

圖4 乳酸添加量對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.4 Effect of the additive amount of lactic acid on sensory score of black soybean tempeh

由圖4可知，感官評分隨著乳酸添加量的增加呈先增高后降低的變化。當(dāng)乳酸添加量為0.5%時(shí)，酸度較低不利于菌絲的生長，且伴有腐敗氣味，可能是由于雜菌生長所致；當(dāng)乳酸添加量在1.5%時(shí)，基質(zhì)的酸度適合少孢根霉的生長，發(fā)酵后黑豆丹貝的表面菌絲致密，呈乳白色糕團(tuán)狀，質(zhì)地結(jié)實(shí)有彈性，香味濃郁，產(chǎn)品質(zhì)量好；當(dāng)乳酸添加量大于2.0%時(shí)，可能是基質(zhì)過酸抑制了少孢根霉的生長，丹貝品質(zhì)較差。因此，乳酸添加量在1.5%左右時(shí)，黑豆丹貝的品質(zhì)較好。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1 模型建立及顯著性分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件，對表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到以產(chǎn)品感官評分為響應(yīng)值，發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)和乳酸添加量(D)之間的回歸方程為：Y=87.72+2.57A+1.28B+3.84C+11.03D-2.05AB+3.83AC+4.07AD-2.57BC+3.75BD-2.42CD-6.73A2-5.96B2-5.94C2-7.43D2。

表3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Design and result of response surface experiment

續(xù) 表

表4 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4可知，回歸模型高度顯著(P<0.0001)，而失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0971>0.05)，決定系數(shù)R2=0.9325，表明該模型對試驗(yàn)擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測。由F值可知各因素對產(chǎn)品感官評分影響的主次順序?yàn)椋篋>C>A>B，即乳酸添加量>接種量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度。交互項(xiàng)AD的P<0.05，AB、AC、BC、BD和CD的P>0.05，因此，A(發(fā)酵時(shí)間)和D(乳酸添加量)的交互作用顯著，其他因素的交互作用不顯著。

2.5.2 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)曲面圖能直觀反映發(fā)酵時(shí)間和乳酸添加量對黑豆丹貝感官評分影響的整體趨勢，等高線形狀可以反映交互作用大小，其排列的密集程度表明發(fā)酵時(shí)間和乳酸添加量變化對產(chǎn)品感官評分的影響程度[15]。

圖5 發(fā)酵時(shí)間和乳酸添加量的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of fermentation time and additive amount of lactic acid

由圖5可知，在接種量和溫度不變的情況下，固定發(fā)酵時(shí)間，黑豆丹貝的感官評分為先陡峭上升到達(dá)最大值后再緩慢下降，表明乳酸添加量對丹貝的感官品質(zhì)影響較大，且在較低水平下對丹貝感官質(zhì)量的影響比高水平突出。同時(shí)，等高線呈橢圓形，說明發(fā)酵時(shí)間和乳酸添加量的交互作用顯著。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到最優(yōu)的理論條件為：發(fā)酵時(shí)間39 h，發(fā)酵溫度34.75 ℃，接種量0.26%，乳酸添加量1.45%，模型預(yù)測感官評分值為94.51分?？紤]到實(shí)際操作的便利，將參數(shù)修整為：發(fā)酵時(shí)間39 h，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量0.26%，乳酸添加量1.5%。采用上述條件進(jìn)行實(shí)際發(fā)酵，做3次試驗(yàn)取其平均值，得到感官評分為93.9分，與預(yù)測值差異不顯著，表明模型擬合程度較好，可以用該發(fā)酵條件制作黑豆丹貝。

2.6 黑豆丹貝產(chǎn)品指標(biāo)

2.6.1 感官指標(biāo)

色澤質(zhì)地：呈白色糕團(tuán)狀，結(jié)實(shí)有彈性；香氣：香味濃郁，氣味純正；滋味：酥軟細(xì)膩。

2.6.2 理化指標(biāo)

氨基酸態(tài)氮：0.87 g/100 g；還原糖16.42 mg/g；可溶性蛋白：61.59 mg/g。

2.6.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)≤2×103CFU/g，大腸桿菌總數(shù)<30 MPN/100 g，致病菌未檢出。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)曲面優(yōu)化，獲得黑豆丹貝固體發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間39 h，發(fā)酵溫度35 ℃，乳酸添加量1.5%，接種量0.26%，此時(shí)產(chǎn)品的感官評分為93.9分?；貧w分析和驗(yàn)證試驗(yàn)表明本試驗(yàn)優(yōu)化的黑豆丹貝發(fā)酵工藝條件切實(shí)可行，為黑豆丹貝的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。