先天性腎積水患兒尿水通道蛋白-1、內(nèi)皮素-1表達(dá)水平及臨床意義

曹戌，周云，嚴(yán)向明，張婷，付明翠，夏紅亮，戴澍

（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 蘇州 215000）

先天性腎積水是小兒泌尿外科常見疾病，發(fā)病率為1%～2%。腎盂輸尿管連接部狹窄、膀胱輸尿管反流、后尿道瓣膜病、輸尿管狹窄及輸尿管囊腫是其常見病因，如不及時(shí)治療常導(dǎo)致終末期腎衰竭[1-2]。腎小球血流動(dòng)力學(xué)的改變及腎小管功能的變化是先天性腎積水的病理生理學(xué)因素。現(xiàn)已知積水腎臟早期的功能變化為濃縮功能受損[3-4]，但其發(fā)生機(jī)制尚不完全明確。水通道蛋白-1（Aquaporin-1,AQP-1）是一種參與水分子轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性通道蛋白，主要分布于近曲小管的頂膜和基底膜。AQP-1 的缺失或表達(dá)下降將導(dǎo)致髓袢降支細(xì)段水通透性的降低，從而影響腎臟的濃縮功能。LI 等[5]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺失AQP-1 的小鼠多表現(xiàn)為中度多尿，且尿滲透壓降低至正常的1/10。因此，AQP-1 在腎臟濃縮功能方面發(fā)揮著重要作用[6]。由于AQP-1 亦可由腎小管上皮細(xì)胞分泌，存在于尿中。且動(dòng)物模型已證實(shí)，梗阻腎臟腎盂中尿AQP-1 的表達(dá)水平會(huì)降低。因此，尿AQP-1 水平可能與積水腎臟的功能變化密切相關(guān)。本研究旨在通過對(duì)積水患兒手術(shù)前后尿AQP-1 表達(dá)情況的研究，獲得相應(yīng)的臨床線索。

內(nèi)皮素-1（Endothelin-1,ET-1）是一種在多種細(xì)胞中均能合成的多肽，在不同組織發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。在腎臟中，ET-1 可促使腎動(dòng)脈及腎小球系膜細(xì)胞收縮，減少腎小球?yàn)V過面積，降低腎血流量及腎小球?yàn)V過率[7]。ALALEH 等[8]、LOPES 等[9]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，梗阻側(cè)腎盂尿ET-1 含量較對(duì)照組增加，梗阻側(cè)腎組織中的ET-1 蛋白含量也較正常對(duì)照組升高，而對(duì)側(cè)腎臟組織及尿ET-1 的變化并不明顯。提示ET-1 主要是在梗阻側(cè)腎臟合成的。因此，與AQP-1 類似，尿ET-1 水平可能與積水腎的損害程度及術(shù)后恢復(fù)情況相關(guān)。國內(nèi)外有這方面報(bào)道，本文希望探討尿ET-1 表達(dá)水平與先天性腎積水患兒的臨床相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本文為前瞻性研究，選取2017年1月—2018年 1月于蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科就診的40 例先天性腎積水患兒作為實(shí)驗(yàn)組。所有患兒在術(shù)前完成超聲、靜脈腎盂造影（IVP）、膀胱造影、ECT、泌尿系CT 等影像學(xué)檢查，以明確腎積水診斷及病因，并評(píng)估積水程度。腎積水的診斷及分度依據(jù)HALBGEWACHS等[10]、SHARIFIAN 等[11]、SFU 分級(jí)法[12]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（見表1、2）。另選40 例于本院就診的患兒作為對(duì)照組，該患兒無泌尿系統(tǒng)疾患。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)為：①嚴(yán)重的心臟、肝臟疾患；②腎功能異常；③泌尿系疾患；④自身免疫性疾??；⑤惡性腫瘤。

表1 腎積水診斷標(biāo)準(zhǔn)及分度

表2 SFU 分級(jí)

1.2 一般資料

實(shí)驗(yàn)組患兒40 例。男性26 例，女性14 例；平均年齡（28.05±5.46）個(gè)月。30 例患兒的病變區(qū)域位于左側(cè)，7 例位于右側(cè)，3 例為雙側(cè)。當(dāng)診斷標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生沖突時(shí)，以評(píng)級(jí)較高的診斷標(biāo)準(zhǔn)定級(jí)。實(shí)驗(yàn)組輕度積水11 例、中度積水15 例，重度積水14 例。病因分析：30 例（30%）為腎盂輸尿管連接部狹窄（uretero-pelvic junction obstruction,UPJO），10 例（10%）為膀胱輸尿管連接處梗阻（uretero-bladder junction obstruction,UVJO）。30 例UPJO 患兒均行腎盂成形術(shù)并保留雙“J”管和導(dǎo)尿管；10 例UVJO 患兒均行輸尿管膀胱再植術(shù)并保留導(dǎo)尿管。對(duì)照組患兒40 例。男性17 例，女性23 例；平均年齡（29.14±6.27）個(gè)月。

1.3 標(biāo)本采集

收集實(shí)驗(yàn)組患兒術(shù)前晨尿、術(shù)中腎盂尿及術(shù)后7 d 尿。對(duì)照組則僅收集晨尿。所有患兒每日補(bǔ)液量約100 ml/kg，且晚上10：00 ～晨7：00 不飲水及補(bǔ)液。將所收集的尿標(biāo)本在室溫下按3 000 r/min 離心20 min，真空冷凍干燥機(jī)對(duì)尿標(biāo)本進(jìn)行20∶1 濃縮，貯存于-80℃冰箱冷凍保存待測(cè)。

1.4 尿AQP-1 及ET-1 濃度的檢測(cè)

尿AQP-1 及ET-1 濃度檢測(cè)采用美國RB 公司的人AQP-1、ET-1 ELISA 試劑盒，并嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法，用人抗AQP-1、ET-1 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的AQP-1、ET-1 與單抗結(jié)合，加入生物素化的人抗AQP-1、ET-1 形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化酶標(biāo)記的Stre Ptavidin 與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450 nm 處測(cè)OD 值，AQP-1、ET-1 濃度與OD 值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中AQP-1、ET-1 濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)流程及觀測(cè)指標(biāo)

①測(cè)量實(shí)驗(yàn)組不同腎積水程度下尿AQP-1 的濃度，與對(duì)照組進(jìn)行比較；②測(cè)量實(shí)驗(yàn)組在術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后尿AQP-1 的濃度，比較3 個(gè)時(shí)期尿AQP-1 的濃度變化；③測(cè)量實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組尿ET-1 的濃度及陽性率，進(jìn)行組間比較；④測(cè)量實(shí)驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)后的血清應(yīng)激指標(biāo)，組內(nèi)比較。血清應(yīng)激指標(biāo)包括：血清腎上腺素濃度、血糖、皮質(zhì)醇、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6）及C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)及隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，在其有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基礎(chǔ)上兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較做χ2檢驗(yàn)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同腎積水程度下患兒尿AQP-1 濃度比較

實(shí)驗(yàn)組輕、中、重度先天性腎積水患兒尿AQP-1濃度分別為（40.0±2.9）、（36.1±4.9）及（31.3±3.4）ng/L。對(duì)照組患兒尿AQP-1 濃度為（41.1±3.5）ng/L。4 組 尿AQP-1 濃度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=103.143，P=0.000）；輕度腎積水患兒尿AQP-1濃度與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中度腎積水患兒尿AQP-1 濃度與對(duì)照組比較降低（P＜0.05），重度腎積水患兒尿AQP-1 濃度與對(duì)照組比較降低（P＜0.05）。

2.2 手術(shù)前后患兒尿AQP-1 濃度比較

實(shí)驗(yàn)組患兒術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后尿AQP-1 濃度分別 為（33.5±4.7）、（24.9±4.0）及（35.2±4.5）ng/L，比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后不同時(shí)期患兒尿AQP-1 濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.741，P=0.025）；實(shí)驗(yàn)組術(shù)中尿AQP-1濃度比術(shù)前尿AQP-1 濃度降低（P＜0.05），術(shù)后尿AQP-1 濃度比術(shù)中尿AQP-1 濃度升高（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組患兒術(shù)后尿AQP-1 濃度與對(duì)照組（41.1±3.5）ng/L 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.252，P=0.000）。

2.3 兩組患兒尿ET-1 濃度及陽性率比較

當(dāng)尿ET-1 濃度≥845.00 pg/mmol Cr（pg/mmol Cr是指經(jīng)尿肌酐校正過的尿檢測(cè)結(jié)果）時(shí)，可認(rèn)定尿中ET-1 陽性。尿ET-1 濃度實(shí)驗(yàn)組術(shù)前為（2 034.41± 892.14）pg/mmol Cr，陽性率為77.50%，陰性率為22.50%。對(duì)照組的濃度為（568.20±212.35）pg/mmol Cr，陽性率為10.00%，陰性率為90.00%。兩組比較，尿ET-1 濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4 兩組患兒血清應(yīng)激指標(biāo)的變化

兩組患兒術(shù)前血清應(yīng)激指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表4）；實(shí)驗(yàn)組患兒術(shù)后腎上腺素、血糖、IL-6 術(shù)后均高于術(shù)前（P＜0.05）；而皮質(zhì)醇、CRP 術(shù)后水平與術(shù)前水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表5）。

表3 兩組患兒尿液ET-1 濃度及陽性率的比較 （n=40）

表4 實(shí)驗(yàn)組術(shù)前與對(duì)照組血清應(yīng)激指標(biāo)的比較 （n=40，±s）

表4 實(shí)驗(yàn)組術(shù)前與對(duì)照組血清應(yīng)激指標(biāo)的比較 （n=40，±s）

組別 腎上腺素/（ng/ml）血糖/（mmol/L）皮質(zhì)醇/（ng/ml）IL-6/（pg/ml）CRP/（mg/L）實(shí)驗(yàn)組 0.17±0.05 4.59±0.35 230.95±18.55 12.43±2.44 12.19±2.38對(duì)照組 0.17±0.04 4.60±0.35 231.06±18.65 12.44±2.40 12.18±2.40t值 9.632 12.418 10.911 9.841 10.724P值 0.841 0.627 0.735 0.816 0.794

表5 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后與對(duì)照組血清應(yīng)激指標(biāo)的比較 （n=40，±s）

表5 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后與對(duì)照組血清應(yīng)激指標(biāo)的比較 （n=40，±s）

組別 腎上腺素/（ng/ml）血糖/（mmol/L）皮質(zhì)醇/（ng/ml）IL-6/（pg/ml）CRP/（mg/L）實(shí)驗(yàn)組 0.27±0.05 5.90±0.41 256.35±20.08 16.80±2.52 15.47±2.61對(duì)照組 0.17±0.04 4.60±0.35 231.06±18.65 12.44±2.40 12.18±2.40t值 36.542 42.715 31.139 47.385 27.703P值 0.037 0.045 0.057 0.043 0.162

3 討論

AQP-1 最初由AGRE 等在紅細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)[13]，隨后又陸續(xù)從動(dòng)物組織中鑒定出9 種水通道蛋白，即AQP-2 至AQP-10。不同亞型的AQP分布于不同組織的細(xì)胞膜上，并與分子轉(zhuǎn)運(yùn)、水電解質(zhì)平衡、腺體分泌等功能相關(guān)。AQP-1 至AQP-4 是參與腎臟重吸收及濃縮功能的重要通道蛋白，其中又以AQP-1 的功能最為關(guān)鍵。近曲小管是腎臟重吸收的主要功能部位，AQP-1 主要分布于近曲小管頂膜和基底膜，在髓襻降支細(xì)段與逆流倍增機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。正常成年人每日腎小球?yàn)V過率約180 L，90%通過近曲小管的AQP-1 完成轉(zhuǎn)運(yùn)。WANG 等[14]通過單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠模型發(fā)現(xiàn)：當(dāng)梗阻發(fā)生時(shí)，腎臟AQP-1 的表達(dá)明顯下調(diào)，腎臟濃縮功能在梗阻早期即受到影響。ZELENINA 等[15]分析解除梗阻后腎臟AQP-1 表達(dá)的變化情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)梗阻解除后的2 d，AQP-1 的表達(dá)開始恢復(fù)，在梗阻解除后的7 d 可有恢復(fù)，而在梗阻解除的21 d，AQP-1 的表達(dá)可基本恢復(fù)至原水平。以上研究都反映出AQP-1 的表達(dá)與腎積水的病理生理變化密切相關(guān)。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組患兒尿ET-1 陽性率及濃度均高于對(duì)照組。提示尿ET-1 表達(dá)水平可作為先天性腎積水患兒的輔助診斷指標(biāo)。TOPCU 等[16]曾測(cè)定單側(cè)UPJO 患兒尿中ET-1 水平。研究顯示，當(dāng)將診斷標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為3 fmol/mg.Cr 時(shí)，通過尿ET-1 水平診斷腎積水的敏感性為74.3%，特異性為90%，整體精度為81.5%。此外，該患兒尿ET-1 水平在腎盂成形術(shù)后12 個(gè)月顯著降低。TATA 認(rèn)為尿ET-1 不僅可以作為診斷先天性腎積水的輔助診斷指標(biāo)，還可作為術(shù)后恢復(fù)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。需要注意的是，TATA 等在研究中僅檢測(cè)了術(shù)后1年患兒尿ET-1 水平，尿ET-1 水平究竟在梗阻解除后早期（12 周），還是在中晚期（＞12 周）時(shí)恢復(fù)，不得而知。此外，由于ET-1 與腎小球動(dòng)脈硬化、腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，而腎臟在梗阻發(fā)生后的早期并不表現(xiàn)出纖維化等改變，尿ET-1 可能不宜作為積水腎臟的早期損傷指標(biāo)，這可能會(huì)影響到ET-1 對(duì)腎積水的診斷效率。類似的，當(dāng)梗阻解除后，腎纖維化、腎小球硬化的恢復(fù)亦是緩慢的過程，尿ET-1 作為腎積水術(shù)后恢復(fù)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)可能缺乏敏感性。綜上所述，尿ET-1 的表達(dá)水平與腎積水的病理生理變化密切相關(guān)，但其作為腎積水診斷指標(biāo)及術(shù)后恢復(fù)監(jiān)測(cè)指標(biāo)的敏感性，可能不如AQP-1，需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)加以分析研究。

綜述所述，尿AQP-1 及ET-1 水平可作為先天性腎積水患兒的輔助診斷指標(biāo)。此外，尿AQP-1 還可作為腎積水患兒術(shù)后恢復(fù)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。