鉻污染區(qū)地下水對大鼠肝臟功能及Caspase-3和PARP表達的影響*

趙秀娟，包翠芬，王琳，柳曉琳

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，遼寧 錦州 121001）

鉻是一種常見的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，水中鉻主要以三價鉻和六價鉻為主[1]。研究表明，六價鉻的毒性比三價鉻毒性大100 倍[2]。鉻通過多種途徑進入身體，在體內(nèi)蓄積后可以引發(fā)多種疾病，如潰瘍、黏膜炎等。肝臟是鉻的主要代謝器官之一[3]。為探討鉻污染區(qū)地下水對人群健康的影響，本研究分別用鉻污染區(qū)地下水及不同濃度重鉻酸鉀灌胃小鼠，觀察其對大鼠肝功能及肝細胞Caspase-3 和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase,PARP）表達的影響，探討鉻可能導(dǎo)致人體肝臟疾病及其損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物選取健康情況相近、SPF 級、同一批次的SD 孕鼠10 只，購自錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心（合格證號：SCXK 遼2014-0004）。于室溫（22±1）℃下喂養(yǎng)，相對濕度為50%～70%，室內(nèi)晝夜分明，實驗期間小鼠可自由活動、攝食及飲水。

1.1.2 實驗試劑重鉻酸鉀K2Cr2O7（分析純，含量≥ 99.8%，天津市華東試劑廠），鉻污染區(qū)地下水（錦州市金廠堡村張衛(wèi)東家深度18 ～20 m、鉻濃度為28.64 mg/L 地下水，由環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所檢測），鉻標準品（北京有色金屬研究總院），蘇木精-伊紅（HE）染色液（上海多烯公司），PARP 抗體、Cleaved Caspase-3（Asp 175）（Cell Signaling Technology 公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

7600-110 型全自動生化分析儀（日本Hitxchi 公司），AAnalyst 800 原子吸收分光光度計（美國Perkin Elmer 公司），ST-60 型全自動消解儀（北京普立泰科儀器有限公司），DK-8A 型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），BX41 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），TGL20M 型高速冷凍離心機（湖南凱達科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 慢性染毒試驗將10 只SD 孕鼠隨機分成空白組、地下水組、低鉻組、中鉻組及高鉻組，每組2 只。分別灌胃蒸餾水、鉻含量為28.64 mg/L 的鉻污染區(qū)地下水，以及劑量為0.8、4.0 和20.0 mg/kg 的重鉻酸鉀溶液。母鼠共產(chǎn)仔76 只（5 組小鼠只數(shù)分別為15、17、14、17 和13 只），第21 天小鼠斷奶，直接灌胃，灌胃劑量不變（0.5 ml/100 g），1 次/d，灌胃期間小鼠自由進食飲水，連續(xù)灌胃21 周。最后1 次灌胃后，禁食24 h 但不禁水。處死全部子代大鼠，采集肝臟組織及血液備用。

1.3.2 肝臟鉻含量的檢測將肝組織從-80℃冰箱中取出，用微量天平精確稱量肝臟（0.40±0.03）g 于消解管中。在電腦軟件中設(shè)置消解管位置，再依次將消解管對應(yīng)放入消解儀中，按照設(shè)定條件進行全自動消解，同時做試劑空白，最后用去離子水定容至50 ml。將原子吸收儀設(shè)定為石墨爐法，調(diào)定肝臟鉻含量的檢測方法后，先繪制鉻標準溶液的標準曲線，再將所有樣品按照檢測方法中設(shè)定的位置依次對應(yīng)放入石墨爐中，檢測肝臟鉻的含量。

1.3.3 肝功能檢測染毒結(jié)束后，稱量每只子代大鼠體重，2%戊巴比妥鈉（0.1 ml/100 g）腹腔注射。待其充分麻醉后，抽取腹主動脈血，分裝在含有抗凝劑及非抗凝劑的采血管中。采血后，將含有抗凝劑的血樣置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將非抗凝劑采血管中的血樣靜置30 min 后放入離心機中，3 500 r/min，4℃離心10 min 后取出血清。用全自動生化分析儀檢測血清總蛋白（total protein,TP）、白蛋白（Albumin,ALB）、球蛋白（Globulin,GLB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的含量。

1.3.4 肝臟HE 染色解剖所有子代大鼠，取其肝臟組織，將一部分肝臟立即放入-80℃冰箱冷凍保存，另一部分放入配置好的10%甲醛溶液中固定。取出固定后的部分肝臟，經(jīng)自來水沖洗（2 h）、梯度濃度乙醇（由低到高）脫水、二甲苯透明、浸蠟（3 次，每次40 min）、石蠟包埋等步驟后，制作肝臟切片（厚度5 mm）。將制作好的肝臟切片經(jīng)二甲苯、梯度濃度乙醇（由高到低）脫蠟復(fù)水后HE 染色，中性樹膠封片并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測肝臟Caspase-3 及PARP的表達制作肝臟石蠟切片，經(jīng)二甲苯透明，梯度濃度乙醇（由高到低）脫蠟復(fù)水后，再經(jīng)3% H2O2溫室孵育15 min，應(yīng)用高壓抗原修復(fù)法，滴加5 % BSA 封閉血清溫室孵育30 min，滴加一抗后放入4℃溫室孵育20 h。次日滴加二抗，37℃孵育30 min 后滴加DAB顯色，待鏡下觀察反應(yīng)充分后放入雙蒸水中終止反應(yīng)。最后HE 復(fù)染，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察Caspase-3 及PARP 的表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，均進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子代大鼠肝臟鉻含量的比較

地下水和重鉻酸鉀染毒子代大鼠肝臟鉻含量的變化顯示，與空白組比較，地下水組與各劑量重鉻酸鉀染毒組肝臟中鉻的含量均升高，且隨著染毒劑量的升高，子代大鼠肝臟中鉻含量呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。地下水組肝臟鉻含量與低鉻組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 子代大鼠肝功能化驗結(jié)果的比較

地下水和重鉻酸鉀染毒子代大鼠血清TP、ALB、GLB 含量和AST、ALT、ALP 活力的變化顯示，與空白組比較，地下水組與各劑量重鉻酸鉀染毒組血清TP、ALB、GLB 的含量均升高，中鉻組和高鉻組各血清指標與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。地下水組與各劑量重鉻酸鉀染毒組血清AST、ALT、ALP 活力均高于空白組，各劑量重鉻酸鉀染毒組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 子代大鼠肝臟鉻含量的比較 （μg/L，±s）

表1 子代大鼠肝臟鉻含量的比較 （μg/L，±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與地下水組比較，P＜0.05；3）與低鉻組比較，P＜0.05；4）與中鉻組比較，P＜0.05

組別 n鉻含量空白組 15 13.20±0.71地下水組 17 14.85±2.251）低鉻組 14 15.72±1.061）中鉻組 17 19.77±1.401）2）3）高鉻組 13 53.30±3.471）2）3）4）F值 979.310P值 0.001

表2 子代大鼠肝功能化驗結(jié)果的比較 （±s）

表2 子代大鼠肝功能化驗結(jié)果的比較 （±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與地下水組比較，P＜0.05；3）與低鉻組比較，P＜0.05；4）與中鉻組比較，P＜0.05

組別 nTP/（g/L）ALB/（g/L）GLB/（g/L）AST/（u/L）ALT/（u/L）ALP（u/L）空白組 15 51.99±3.57 27±1.25 24.27±1.16 61.53±6.09 25.47±2.30 49.73±7.45地下水組 17 52.67±6.60 29.24±3.07 25.76±2.97 70.59±7.96 29.24±4.41 63.59±1.53低鉻組 14 53.71±6.19 29.50±4.43 26.36±3.75 72.36±3.931）2） 30.93±3.241）2） 65.64±7.241）2）中鉻組 17 60.33±5.071）2）3） 34.59±2.031）2）3） 30.71±2.841）2）3） 91.24±12.351）2）3） 39.24±8.491）2）3） 75.65±12.771）2）3）高鉻組 13 70.31±4.591）2）3）4） 36.92±4.521）2）3）4） 34.69±2.171）2）3）4） 125.15±25.841）2）3）4） 58.77±18.661）2）3）4） 97.54±13.071）2）3）4）F值 28.919 32.439 34.699 42.732 29.475 37.719P值 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

2.3 子代大鼠肝臟HE 染色結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察可見空白組肝細胞排列整齊，呈條索狀，細胞質(zhì)圓潤飽滿。地下水組肝細胞出現(xiàn)嗜酸性樣改變且排列不規(guī)則。隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加肝細胞表現(xiàn)為不同程度的嗜酸性樣變，排列紊亂，細胞質(zhì)間隙加大，甚至呈現(xiàn)空泡性樣變。少數(shù)高鉻組出現(xiàn)肝竇擴張，淤血及少量滲出性出血，偶見壞死灶。見圖1。

2.4 肝臟組織Caspase-3 及PARP 表達

熒光顯微鏡下可觀察空白組肝細胞排列規(guī)則，Caspase-3 及PARP 陽性細胞少見。地下水組可見肝細胞胞質(zhì)充盈度增加，可見少許陽性細胞。隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加，肝細胞排列逐漸稀疏紊亂，陽性細胞逐漸增多。見圖2、3。

圖1 子代大鼠肝臟組織病理改變 （HE×400）

圖2 子代大鼠肝臟組織Caspase-3 表達 （免疫組織化學(xué)×400）

圖3 子代大鼠肝臟組織PARP 表達 （免疫組織化學(xué) ×400）

3 討論

肝臟是鉻的主要代謝器官之一，攝入過多的鉻可以導(dǎo)致肝臟受損，甚至?xí)掳4]。研究發(fā)現(xiàn)，長期居住在鉻污染區(qū)的居民惡性腫瘤發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)[5]。血清學(xué)指標的檢測對檢查肝臟疾病具有十分重要的作用。TP 可分為ALB 和GLB 兩類，在機體中具有維持血液正常膠體滲透壓和pH 值、運輸多種代謝物、免疫作用等多種功能。GLB 升高，可引起慢性炎癥、感染及免疫系統(tǒng)等疾病。本實驗結(jié)果顯示，地下水組與鉻染毒組TP、ALB、GLB 的含量均高于空白組；隨著染毒劑量的升高，大鼠血清TP、ALB、GLB 的活力呈上升趨勢。這說明六價鉻能夠造成血清蛋白含量發(fā)生變化，且鉻劑量越高效果越明顯。

反映肝細胞損傷的重要標志物包括ALT、AST[3]和ALP。ALT 主要存在于肝臟、心臟組織細胞中，AST 主要分布在心肌、肝臟、骨骼肌和腎臟等組織中。ALP是廣泛分布于肝臟、骨骼、腸、腎等組織中，通常輔助ALT 鑒別肝膽疾病。正常情況下，血液中的ALT 和AST 含量較低，但當相應(yīng)組織細胞受損時，細胞膜通透性增加，會使胞漿內(nèi)的ALT 和AST 釋放入血，從而導(dǎo)致血清濃度升高。劉學(xué)慧等[6]發(fā)現(xiàn)灌溉污水可對大鼠肝細胞造成損傷。本實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，地下水組與鉻染毒組AST、ALT 和ALP 的活性均增高；但地下水組與低鉻組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；隨著染毒劑量升高，大鼠血清AST、ALT 和ALP 活性呈上升趨勢。該結(jié)果與陳佳等[7]研究結(jié)果相符，這說明六價鉻染毒能夠造成大鼠肝功能損傷，鉻在肝臟內(nèi)蓄積后可以干擾或破壞肝細胞生長，且鉻劑量越高肝功能損傷越嚴重。

與空白組比較，地下水組與重鉻酸鉀染毒組肝臟中鉻的含量均有增長，且隨著鉻濃度增加，除地下水組與低鉻組外，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明鉻在肝臟內(nèi)有蓄積作用。

HE 染色結(jié)果顯示，隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加，肝細胞表現(xiàn)為不同程度的嗜酸性樣變，肝索排列逐漸紊亂；部分肝細胞質(zhì)間隙加大，核濃縮且偏移；部分肝細胞出現(xiàn)空泡性樣變；少數(shù)出現(xiàn)脂肪性樣變。陳佳等[7]發(fā)現(xiàn)用高劑量1/2 LD 50（85.5 mg/kg）重鉻酸鉀溶液灌胃小鼠35 d 后，肝細胞之間有炎癥細胞浸潤，部分肝細胞組織出現(xiàn)大片細胞液化壞死，甚至出現(xiàn)細胞核碎裂、溶解。本實驗未發(fā)現(xiàn)該結(jié)果很可能是由于重鉻酸鉀染毒劑量差異導(dǎo)致。由此說明鉻不僅可以在短期內(nèi)對肝臟產(chǎn)生中毒效應(yīng)，也可以產(chǎn)生蓄積作用，干擾肝細胞正常代謝，導(dǎo)致細胞器功能受損，且蓄積時間越長，鉻劑量越高，肝功能損傷越明顯。

Caspase-3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，PARP 酶是細胞凋亡核心成員半胱天冬酶（Caspase）的切割底物，PARP 失去酶活力會加速細胞的不穩(wěn)定，它們在DNA 損傷修復(fù)與細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者在體外實驗中證實Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)肝細胞凋亡[8]。本實驗免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加，肝細胞排列逐漸稀疏紊亂，陽性細胞逐漸增多。由此說明鉻在肝臟內(nèi)蓄積后能夠使Caspase-3 活性增強，PARP 失去活性，從而導(dǎo)致肝細胞凋亡。

綜上所述，六價鉻長期暴露對大鼠的肝功能造成一定損傷并且對血清生化指標產(chǎn)生影響。但是具體通過哪種通路發(fā)揮作用尚未可知，有待更深入研究。由于鉻污染區(qū)地下水組與低鉻組各項指標結(jié)果相仿，因此推斷，長期飲用鉻污染區(qū)地下水可能對肝臟造成一定損傷。眾多調(diào)查顯示，鉻污染區(qū)居民慢性病及腫瘤發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，建議當?shù)卣扇∮行Т胧乐广t污染的發(fā)生。