興安杜鵑基本培養(yǎng)基和外殖體選擇的初步研究

杜鳳國(guó) 呂偉偉 王歡

摘要 [目的]研究興安杜鵑苗木快繁技術(shù)，為興安杜鵑大規(guī)模園林綠化應(yīng)用提供技術(shù)保障。[方法]以興安杜鵑的葉芽、花芽、葉片、莖尖、莖段為外植體，以MS、WPM、Read、B5為培養(yǎng)基，采用不同采集時(shí)間、不同消毒方法，通過(guò)接種、培養(yǎng)、觀察和對(duì)比分析，對(duì)興安杜鵑的快速繁殖進(jìn)行研究。[結(jié)果]興安杜鵑組織培養(yǎng)最佳基本培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基;最佳外植體為1.5～2.0 cm莖尖和莖段;最佳滅菌方法為70%乙醇30 s結(jié)合0.1% HgCl2 10 min;最佳取材時(shí)間為3月中旬至5月中旬。[結(jié)論]該研究可為綠化苗木生產(chǎn)、城鎮(zhèn)綠化及鄉(xiāng)村振興生態(tài)宜居目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供支撐。

關(guān)鍵詞 興安杜鵑;組織培養(yǎng);快速繁殖

中圖分類號(hào) S 685.21 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0136-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.037

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]To study the rapid propagation technology of Rhododendron dauricum seedlings， and provide technical support for the largescale landscaping application of Rhododendron dauricum.[Method]The leaf buds， flower buds， leaves， stem tips and stem segments of Xing'an Rhododendron were used as explants， and MS， WPM， Read B5 were used as the medium.The rapid propagation of Rhododendron dauricum ?studied by using explants with different sampling time and disinfection methods through inoculation， culture， observation and comparative analysis.[Result]The best basic medium for tissue culture of Rhododendron dauricum was WPM;the optimal explants was 1.5-2.0 cm long stem tips and stem segments;the best sterilization method on the surface of explants was 70% alcohol 30 s and then combined with 0.1% HgCl2 10 min;the best season for sampling time was from midMarch to midMay.[Conclusion]This research can provide technique to reproduction of greening seedlings，urban greening and realization of ecological livable target ?in rural vitalization.

Key words Rhododendron dauricum;Tissue culture;Rapid propagation

興安杜鵑（Rhododendron dauricum L.）又名金達(dá)萊、滿山紅、達(dá)子香、映山紅等，屬于杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）的落葉或常綠灌木，主要分布于東北地區(qū)的大小興安嶺和長(zhǎng)白山林區(qū)，多生于山脊處的石砬子、陡壁、荒山、干山坡，耐寒冷、干旱和瘠薄。先花后葉，其花紫紅色，十分美麗，香味濃郁。葉和花的提取物具有鎮(zhèn)定、利尿、抗腫瘤的作用，是一種集觀賞、藥用和芳香于一體的經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的野生木本花卉，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前一些學(xué)者對(duì)興安杜鵑種子及苗木生長(zhǎng)特性[1]、生理特性[2]、葉化學(xué)成分[3-4]、精油化學(xué)成分[5]、藥用價(jià)值[6]、種子與扦插繁殖[7-8]等進(jìn)行了研究;還有學(xué)者對(duì)同屬的其他種如：杜鵑[9]、西洋杜鵑[10]等組織技術(shù)進(jìn)行了研究。對(duì)于興安杜鵑組培技術(shù)，雖有學(xué)者進(jìn)行了研究并取得進(jìn)展，但污染率和褐化率嚴(yán)重，只形成部分愈傷組織[11]。隨著城市林業(yè)和鄉(xiāng)村振興生態(tài)宜居建設(shè)的深入推進(jìn)，興安杜鵑正以它獨(dú)特的先花后葉觀賞特性，日益越受到人們的青睞。人們直接

從森林中挖掘野生的興安杜鵑植株栽植在一些城市公園、廣場(chǎng)、道路等園林綠地上，不僅成本高，而且嚴(yán)重破壞了森林生態(tài)環(huán)境。為加快興安杜鵑在城鄉(xiāng)綠化上的應(yīng)用，必須解決快繁大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木問(wèn)題，而組織培養(yǎng)是保持原種優(yōu)良特性、不受季節(jié)限制的一種快繁苗木技術(shù)。為此，筆者從基本培養(yǎng)基和外植體選擇等方面研究興安杜鵑苗木組織培養(yǎng)技術(shù)，以期為綠化苗木生產(chǎn)、城鎮(zhèn)綠化及鄉(xiāng)村振興生態(tài)宜居目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

2017年3月中旬，從吉林市雷達(dá)山上采集興安杜鵑的休眠枝條，在溫室中進(jìn)行水培，以其萌發(fā)的芽作為試驗(yàn)材料。5月中旬，采集興安杜鵑幼嫩枝條，放于水中進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，接種時(shí)以其幼嫩葉片、莖尖及莖段為外植體。后于7月中旬采集興安杜鵑嫩枝，進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1 材料滅菌

（1）花芽、葉芽的消毒方法。將采下的萌發(fā)芽用毛刷刷去表面的浮塵，用洗滌劑輕微刷洗，在自來(lái)水中沖洗1 h，可把雜菌洗掉約60%。然后采用3組消毒方法：70%的乙醇中浸泡30 s，再結(jié)合0.1%的HgCl2分別消毒6、10、15 min;0.1% HgCl2單獨(dú)使用，分別消毒6、10、15 min;70%乙醇30 s。消毒過(guò)程中要用玻璃棒不停攪拌，在超凈工作臺(tái)上，剝?nèi)ネ鈱友亏[，露出內(nèi)芽，再用無(wú)菌水沖洗3～5次。

（2）葉片、莖尖及莖段消毒方法的選擇及接種。用清水將外植體表面沖洗干凈，用70%的乙醇滅菌30 s，然后用0.1%的HgCl2消毒10 min后，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.2 基本培養(yǎng)基的篩選 試驗(yàn)選用2.0 mg/L ZT+0.5 ?mg/L IBA的激素配比，比較MS、WPM、Read和B5 4種培養(yǎng)基對(duì)興安杜鵑快速繁殖的影響。

1.3 最佳外植體的選擇 分別采用花芽、葉芽、葉片、莖尖及莖段5種外植體，研究不同外植體對(duì)再生植株的影響，從而篩選出最佳外植體。

1.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度（23±1）℃，光照時(shí)間為12～14 h/d，光照強(qiáng)度約2 000 Lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳培養(yǎng)基的篩選 將外植體消毒處理后，分別接種到4種培養(yǎng)基上，附加2.0 mg/L ZT+0.5 ?mg/L IBA，隨機(jī)選取葉芽、花芽、莖段、莖尖為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，觀察外植體反應(yīng)情況。30 d 后統(tǒng)計(jì)污染率、芽分化率，計(jì)算增殖倍數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，MS培養(yǎng)基上外植體幾乎全部褐化死亡，偶有存活的，幾乎不形成愈傷組織，形成的嫩枝短小細(xì)弱，葉片卷曲，長(zhǎng)勢(shì)很差。WPM培養(yǎng)基上外植體增殖系數(shù)最高，腋芽生長(zhǎng)健壯，且腋芽又生腋芽，形成一叢灌木狀小枝，小枝節(jié)間較長(zhǎng)，葉片比較平展，有利于光合作用，從而為自身提供更多的養(yǎng)分，生長(zhǎng)狀況良好;從產(chǎn)生愈傷組織來(lái)看，WPM培養(yǎng)基上的愈傷組織直徑較大，愈傷組織黃綠色，致密，生長(zhǎng)快，發(fā)育良好。Read培養(yǎng)基上外植體腋芽長(zhǎng)勢(shì)較好，但增殖系數(shù)不高，產(chǎn)生的愈傷組織黃白色，疏松，長(zhǎng)勢(shì)一般，分化少，生長(zhǎng)慢。B5培養(yǎng)基上外植體腋芽長(zhǎng)勢(shì)一般，愈傷組織白色疏松，直徑約1.2 cm，增殖倍數(shù)較高，但發(fā)育不正常。

觀察比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是從不定芽的分化發(fā)育情況，還是從愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，興安杜鵑都在WPM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況較好。因此，筆者選擇WPM作為興安杜鵑快速繁殖的基本培養(yǎng)基。

2.2 消毒方法的選擇 在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[3-6]，該試驗(yàn)選用70%乙醇，消毒30 s，結(jié)合不同時(shí)間的0.1%HgCl2消毒進(jìn)行對(duì)比，從而選出有效的消毒方法，將外植體接種到WPM+ZT 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)染菌率和存活率。由于消毒劑會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生傷害，因此，需要統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和存活率，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可看出，將外植體用70%乙醇消毒30 s后再用0.1% HgCl2消毒10 min的消毒效果最好，存活率可以達(dá)到88%。表面消毒劑的使用要求既要?dú)⑺啦牧媳砻娴奈⑸?，又不至于損傷材料組織，影響生長(zhǎng)。70%乙醇有更強(qiáng)的穿透力和殺菌力，在其中浸潤(rùn)30 s，具有浸潤(rùn)和滅菌的雙重作用，但它也能殺死外植體細(xì)胞、組織，會(huì)把材料損壞，導(dǎo)致死亡，用70%乙醇消毒的存活率最高也只有28%。消毒時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)外植體的存活和污染有很大影響，時(shí)間越長(zhǎng)，染菌率下降越明顯，如0.1% HgCl2 15 min的污染率（5%）比0.1% HgCl2 6 min的污染率（40%）要低，說(shuō)明消毒效果要好，可是存活率也隨之下降?？紤]外植體的存活及消毒劑作用時(shí)間長(zhǎng)短的影響程度，試驗(yàn)確定外植體的最適方法為70%乙醇消毒30 s+0.1% HgCl2消毒10 min，此時(shí)外植體的存活率高，污染率也較低。

2.3 最佳外植體的選擇 試驗(yàn)選擇了水培枝條的花芽和葉芽，野外枝條的莖尖、莖段及葉片作為外植體?；ㄑ亢腿~芽剝?nèi)パ亏[，莖尖、莖段剪成1.5～2.0 cm，葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的方塊接種在基本培養(yǎng)基中，附加ZT 2.0 ?mg/L+IBA 0.5 ?mg/L，30 d后觀察外植體生長(zhǎng)分化狀況，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3表明，從愈傷組織形成來(lái)看，莖尖、莖段、葉片均有愈傷組織形成，但是葉片的愈傷組織形成率較低，只有50%，并且葉片的污染率也較高，所以從愈傷組織途徑進(jìn)行誘導(dǎo)可以選擇莖尖、莖段;從叢生芽的分化上，葉芽的叢生芽分化率為66.66%，增殖系數(shù)為2.2倍，而莖尖的叢生芽分化率為83.33%，莖段的叢生芽分化率為83.72%，而且叢生芽的增殖系數(shù)較高（達(dá)到了3.6～4.0倍），叢生芽生長(zhǎng)健壯，生長(zhǎng)狀況良好，所以選用1.5～2.0 cm的莖尖和莖段作為外植體。

2.4 最佳取材時(shí)期 為了確定最佳取材季節(jié)，筆者分別在3月中旬、5月中旬、7月中旬進(jìn)行了3次取材，接種在基本培養(yǎng)基2.0 mg/L ZT+0.5 ?mg/L IBA上，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率以及分化率，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可看出，3月中旬與5月中旬取材的外植體污染率比較低，褐化率都為0，分化率分別達(dá)到84.09%和83.33%;而7月中旬取材的興安杜鵑已經(jīng)半木質(zhì)化，污染率和褐化程度都比較嚴(yán)重，分化率僅33.33%。因此，可以在3月中旬至5月中旬。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)得出以下結(jié)論：

（1）最佳培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基。從誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生、芽分化和增殖系數(shù)綜合考慮，最佳培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基，但要確定生根階段的最佳培養(yǎng)基，還需要通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)確定。

（2）最佳消毒方法為70%乙醇消毒30 s，而后用0.1% HgCl2消毒10 min。但在選擇消毒劑時(shí)，既要考慮其消毒殺菌的能力，還要考慮是否易于被蒸餾水沖洗或可自行揮發(fā)。該試驗(yàn)選用的HgCl2 較難去掉。因此，要充分地沖洗，以達(dá)到零殘留。

（3）最佳外植體為1.5～2.0 cm的莖尖和莖段。在快繁時(shí)，外植體不能過(guò)大，過(guò)大消毒不徹底，易于污染，過(guò)小組培不易成活。同時(shí)，莖尖是樹(shù)木的生長(zhǎng)點(diǎn)，在來(lái)源上往往受到限制。因此，實(shí)際生產(chǎn)中可以將莖尖與莖段相結(jié)合進(jìn)行應(yīng)用。

（4）最佳取材時(shí)期為3月中旬至5月中旬。取材過(guò)早枝條處于休眠狀態(tài)，外植體對(duì)于誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無(wú)反應(yīng)，取材過(guò)晚外植體在組織培養(yǎng)中易褐化。因此，取材時(shí)間以芽萌動(dòng)和生長(zhǎng)季節(jié)早期為宜。

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