熒光染色法和氫氧化鉀濕片法在診斷淺部真菌感染中的敏感度比較

楊顏龍 張素敏 易松柏 周天玖 張 禁

氫氧化鉀濕片法是門(mén)診真菌鏡檢常用的方法。其對(duì)經(jīng)驗(yàn)要求較高，視野對(duì)比度較差，易出現(xiàn)漏診或誤診。近年熒光染色法漸用于真菌鏡檢領(lǐng)域，其機(jī)理是：真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)，可與熒光染色劑里的熒光素產(chǎn)生特異性結(jié)合，在特定波段紫外光照射下，菌絲和孢子發(fā)出亮綠或亮藍(lán)色的熒光，易于區(qū)分背景和雜質(zhì)。本研究分別應(yīng)用兩種方法同視野下檢測(cè)淺部真菌感染患者466例，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院皮膚科門(mén)診2017年8月至2018年8月臨床表現(xiàn)典型[1]的淺部真菌感染患者466例，其中手足癬181例、體股癬168例、花斑糠疹52例、甲癬40例、頭癬25例；分別選擇其易檢出部位的皮屑、甲屑、斷發(fā)發(fā)根作為檢驗(yàn)標(biāo)本。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 臨床表現(xiàn)與病史符合淺部真菌感染且近期局部或系統(tǒng)未使用過(guò)抗真菌藥物者。

1.3 研究方法 檢驗(yàn)師先使用氫氧化鉀濕片法，對(duì)患者進(jìn)行取材、鏡檢至判定結(jié)果；再由同一皮損區(qū)取材，熒光染色法不開(kāi)熒光燈、打開(kāi)熒光燈鏡檢，分別判定結(jié)果并分別計(jì)時(shí)。再由護(hù)士使用兩種方法來(lái)判定結(jié)果并分別計(jì)時(shí)。計(jì)時(shí)分取材制片和讀取結(jié)果兩段。由另一名檢驗(yàn)師再次復(fù)核結(jié)果，若檢驗(yàn)結(jié)果有爭(zhēng)議，則重新制片觀察。由一名醫(yī)師負(fù)責(zé)本研究診斷、計(jì)時(shí)、拍照、統(tǒng)計(jì)任務(wù)。

1.4 取材及檢測(cè)方法 皮損處均用75%乙醇消毒后取材。手足癬、體股癬、花斑糠疹均取皮屑，鈍頭刀刮取皮損炎性活動(dòng)邊緣鱗屑；甲癬取甲屑，先刮除表層的碎甲屑，再取接近正常甲組織的甲下碎屑；頭癬取斷發(fā)發(fā)根，鑷子拔取病發(fā)。取材時(shí)，載玻片需要放置在水平位置上，將刮取的標(biāo)本均勻置于載玻片中心。氫氧化鉀濕片法滴上一滴氫氧化鉀液，蓋上蓋玻片輕壓排出氣泡，使用酒精燈略微加熱，再次輕壓攤勻標(biāo)本。用加裝萊卡熒光顯微鏡圖文分析系統(tǒng)的奧林巴斯 CX31顯微鏡觀察。熒光染色法則滴上一滴真菌熒光染色液(蘇宿械備20170027號(hào))，覆蓋整個(gè)樣品，據(jù)標(biāo)本不同，靜置30 s～2 min不等，蓋上玻片，然后輕壓，擠出氣泡，鋪勻標(biāo)本，完成制片。用同一臺(tái)顯微鏡觀察，先不開(kāi)熒光，用10倍物鏡尋找真菌視野，40倍物鏡觀察確認(rèn)，確定是否有真菌菌絲或孢子結(jié)構(gòu)存在，并拍照，過(guò)程同普通氫氧化鉀濕片法。然后打開(kāi)熒光，尋找菌絲、孢子。在有無(wú)熒光的同視野下拍照、存檔。最后，分別統(tǒng)計(jì)出熒光染色法和氫氧化鉀濕片法的陽(yáng)性率，分析比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 同視野下氫氧化鉀濕片法與熒光染色法直觀比較 甲癬、手癬、頭癬的檢測(cè)中，兩種方法差別明顯。氫氧化鉀濕片法的背景雜亂、孢子、菌絲不易辨認(rèn)、陽(yáng)性率低，需費(fèi)時(shí)尋找陽(yáng)性目標(biāo)。特別是由護(hù)士來(lái)讀取結(jié)果時(shí)，常會(huì)把陽(yáng)性結(jié)果判斷為陰性，而打開(kāi)熒光后，菌絲、孢子顯現(xiàn)清晰，可快速確認(rèn)陽(yáng)性目標(biāo)。無(wú)論護(hù)士和檢驗(yàn)師，所得結(jié)果基本一致?；ò呖氛?、體股癬、足癬，陽(yáng)性率均較高，兩種方法差別不大，但熒光染色法的陽(yáng)性率更高。從效果來(lái)看，單純使用氫氧化鉀制片和使用熒光液制片且不打開(kāi)熒光燈，得到的效果是基本沒(méi)有區(qū)別。各種淺部真菌病在同一標(biāo)本、同視野下采用兩種方法觀察，顯示熒光染色法陽(yáng)性率高、敏感度高。見(jiàn)圖1～6。黑色箭頭所指為陽(yáng)性目標(biāo)(菌絲、孢子)、紅色箭頭所指為易干擾診斷的東西(雜質(zhì)、重偽影、氣泡等)。

圖11a:體癬標(biāo)本，菌絲與背景對(duì)比差，但可見(jiàn)到菌絲(×400)；1b:菌絲與背景對(duì)比良好，菌絲明顯(×400)圖22a:足癬標(biāo)本，可見(jiàn)菌絲，有偽影(×400)；2b:菌絲明顯，偽影消失(×400)圖33a:甲癬標(biāo)本，菌絲不易找到，可見(jiàn)氣泡、雜質(zhì)(×100)；3b:視野中心見(jiàn)明顯菌絲，可見(jiàn)氣泡、雜質(zhì)(×100)圖44a:花斑糠疹標(biāo)本，可見(jiàn)大量短棒狀菌絲，與背景對(duì)比度不高，未見(jiàn)到孢子；可見(jiàn)黑色雜質(zhì)干擾判斷(×400)；4b:可見(jiàn)大量明亮的短棒狀菌絲，且可見(jiàn)圓形孢子，未見(jiàn)雜質(zhì)(×400)圖55a:頭癬標(biāo)本，可見(jiàn)毛根殘缺，隱約可見(jiàn)孢子或者菌絲；右下方是否為孢子不易判斷(×100)；5b:發(fā)根處明顯鏈狀孢子，右下方看到成堆的孢子(×100)圖66a:頭癬標(biāo)本，為圖5的局部(發(fā)根的右上部分)，亦可見(jiàn)到鏈狀孢子；右側(cè)可見(jiàn)雜質(zhì)(×400)；6b:鏈狀孢子顯影良好，雜質(zhì)顯影不明顯(×400)

2.2 氫氧化鉀濕片法與熒光染色法陽(yáng)性率比較 兩種方法的總陽(yáng)性率分別為91.42%和97.64%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=17.46，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩種方法在各種淺部真菌病鏡檢結(jié)果比較

3 討論

氫氧化鉀濕片法真菌鏡檢臨床應(yīng)用多年，目前仍有其應(yīng)用價(jià)值[1]。但該方法用于甲屑堅(jiān)硬、皮屑肥厚的甲癬、手癬、頭癬時(shí)，常需加熱，制片過(guò)程平均需3 min左右，影響效率[2]。熒光染色法真菌鏡檢，滴加熒光液1 min左右，無(wú)需加熱即可開(kāi)始讀取結(jié)果。讀取結(jié)果時(shí)，氫氧化鉀濕片法視野內(nèi)，背景與真菌菌絲、孢子的色澤和亮度差別不大，特別是操作人員經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)，常反復(fù)調(diào)整視野層面、來(lái)回多個(gè)視野尋找，才敢確認(rèn)是否陽(yáng)性。如檢驗(yàn)師平均2 min內(nèi)，可以確認(rèn)陽(yáng)性的標(biāo)本，經(jīng)驗(yàn)不足的護(hù)士，則需要5 min左右，其對(duì)操作人員的經(jīng)驗(yàn)依賴(lài)性大。而熒光染色法，菌絲、孢子會(huì)顯示出亮藍(lán)的熒光，與視野背景對(duì)比度高，檢驗(yàn)師、護(hù)士均能在1 min內(nèi)確認(rèn)結(jié)果是否陽(yáng)性，工作效率較高。

在花斑糠疹、體癬、股癬、足癬檢查時(shí)，因標(biāo)本細(xì)薄，易于溶解，且菌絲、孢子形態(tài)易于辨認(rèn)，檢驗(yàn)師與護(hù)士所需時(shí)間差別不太明顯，但制片過(guò)程仍是熒光染

色法的效率較高。兩種方法都會(huì)因雜質(zhì)、氣泡等而干擾判斷，尤其氫氧化鉀濕片法，雜質(zhì)、氣泡、油脂滴常被誤認(rèn)為是菌絲、孢子，經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)，更易誤判。在使用熒光后，真菌孢子、菌絲顯示明亮的藍(lán)色熒光，與背景微弱灰藍(lán)色對(duì)比明顯，可一目了然判斷孢子、菌絲是否存在，提高真菌檢查陽(yáng)性率及準(zhǔn)確率[3]。

本研究同視野下比較兩種檢查方法，與其他研究相比較，更能體現(xiàn)出熒光法的優(yōu)勢(shì)[4，5]。目前兩種檢測(cè)方法均有其臨床使用價(jià)值，但熒光染色法操作更簡(jiǎn)便、敏感度高，檢出結(jié)果快速、準(zhǔn)確，值得臨床應(yīng)用。