隱匿性HBV感染患者HBV S基因突變特點及突變病毒株致瘤性研究

李 奇，張 凱，思蘭蘭，陳建宏，劉桃園，紀(jì) 冬，李曉東，劉 妍，徐東平

隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection,OBI）是指現(xiàn)有技術(shù)檢測血清HBsAg陰性，但血清和/或肝組織HBV DNA陽性的HBV感染狀態(tài)[1]。目前OBI流行情況差異較大，檢出率約為0.002%～0.180%[2-4]，與HBV流行區(qū)、人群血清學(xué)特點、樣本數(shù)量及檢測方法靈敏度等有關(guān)。目前肝病人群中OBI的發(fā)生率少有報道。

OBI的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，已鑒定的OBI相關(guān)突變多位于HBV S基因主要親水區(qū)（major hydrophilic region, MHR），MHR內(nèi)發(fā)生堿基替換、插入或缺失突變，可能會發(fā)生新增N-糖基化突變，即在原有s146-148 NCT N-糖基化位點基礎(chǔ)上，增加NXT/S（X為P以外的任何氨基酸殘基）新的N-糖基化位點。既往研究顯示前S/S基因突變與肝臟疾病尤其是肝細(xì)胞癌的進(jìn)展密切相關(guān)[5-8]，而S基因新增N-糖基化突變是否具有致瘤性尚不清楚。本研究回顧性分析了10 359例肝病患者臨床資料，了解患病人群中OBI檢出率及HBV S基因MHR突變特點，同時對1例典型OBI患者來源的1株新型N-糖基化突變病毒株體外細(xì)胞水平致瘤性進(jìn)行分析，具體情況報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2011年9月—2016年3月在中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心就診并收集到血清樣本的10 359例肝病患者作為研究對象，包括2904例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者，1371例藥物、酒精、自身免疫以及不明原因肝炎患者，4258例肝硬化（liver cirrhosis, LC）患者，1557例肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）患者，218例肝衰竭患者和51例HBV、HCV合并感染患者。OBI診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2008年歐洲肝臟研究學(xué)會在意大利發(fā)布的專家共識[1]。

新型突變株來源患者：診斷為原發(fā)性肝癌，4次采集患者血清，HBsAg的檢測值均為陰性，但血清中HBV DNA均為陽性，且病毒載量隨病程進(jìn)展逐漸升高[9]。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基及嘌呤霉素（puromycin, PM）購自美國Gibco公司；pLVX-Puro慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒購自北京典型培養(yǎng)物保藏中心；質(zhì)粒提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑盒購自德國Roche公司；去糖基化酶PNGase F購自美國NEB公司；組氨酸（histidine, His）標(biāo)簽蛋白小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自北京全式金公司；Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光液購自美國Thermo Fisher公司；細(xì)胞劃痕試驗專用培養(yǎng)插件購自德國Ibidi公司；細(xì)胞增殖試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購自上海翊圣生物公司；細(xì)胞小室遷移分析試劑盒購自美國Corning公司；細(xì)胞周期和活性氧檢測試劑購自上海碧云天公司。相關(guān)引物及測序由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.3 方法

1.3.1 篩選OBI患者并分析HBV S基因MHR特點 篩選血清HBsAg陰性、HBV DNA陽性人群即OBI患者，分析其臨床診療資料并檢測其HBV S基因序列。通過MegAlign軟件分析比對MHR突變情況，比對的HBV標(biāo)準(zhǔn)序列（AF458664C2、AB033554）來自 NCBI。

1.3.2 pLVX-Puro-S重組質(zhì)粒構(gòu)建 從課題組前期構(gòu)建的野生型及突變型質(zhì)粒中擴(kuò)增S基因和His標(biāo)簽[10]，將EcoR I和Xba I雙酶切PCR產(chǎn)物獲得的126-127“RPCMNCTI”插入新增N-糖基化突變株（N-glycosylation, NG）和野生株（wild- type,Wt）克隆入pLVX-Puro慢病毒表達(dá)載體，獲得pLVX-Puro-S-NG、pLVX-Puro-S-Wt重組質(zhì)粒。

1.3.3 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和鑒定 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的293 T細(xì)胞來包裝病毒，收集病毒上清并感染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，用終濃度4 μg/ml的PM篩選出空載體對照組HepG2-Mock、野生組HepG2-Wt以及突變組HepG2-NG穩(wěn)定細(xì)胞系。收集3組細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解細(xì)胞，離心后收集上清。將上清樣品分成2份，1份用沸水煮10 min使蛋白充分變性，1份用去糖基化酶PNGase F處理，然后用Western Blotting方法鑒定His標(biāo)簽?zāi)康牡鞍椎谋磉_(dá)。

1.3.4 突變病毒株致瘤性分析實驗

1.3.4.1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力 調(diào)整3組細(xì)胞濃度為 5×104個 /ml，取 100 μl接種于 96 孔板，按照CCK-8試劑盒說明書方法分別在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h檢測吸光值。

1.3.4.2 細(xì)胞劃痕實驗 3組細(xì)胞分別接種于細(xì)胞劃痕實驗培養(yǎng)插件中（每孔2.4×104個細(xì)胞/80 μl），待細(xì)胞貼壁后拔除插件，分別于0 h和48 h在顯微鏡下測量劃痕寬度并拍照，計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度-相應(yīng)時間點劃痕寬度）/0 h劃痕寬度。

1.3.4.3 細(xì)胞小室遷移實驗 以無血清培養(yǎng)基調(diào)整3 組細(xì)胞濃度為 2.5×105個 /ml，取 200 μl加入上室中，下室加入600 μl含20% FBS的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用棉球擦拭除去上室非遷移細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4.4 平板克隆實驗 將3組細(xì)胞按每孔1000個細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色，計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.3.4.5 細(xì)胞周期檢測 收集處于對數(shù)生長期的3組細(xì)胞，每組1×106個細(xì)胞。加入4 ℃預(yù)冷的70%乙醇溶液固定過夜，加入碘化丙啶染色液，37 ℃孵育30 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

1.3.4.6 細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）檢測 將3組細(xì)胞按每孔1×106個細(xì)胞接種于6孔板中。待80%融合時，加入終濃度為10 μM熒光探針DCFH-DA，37 ℃孵育30 min，按試劑盒說明書檢測ROS含量。

以上6個試驗每組均設(shè)3個復(fù)孔，并做3次獨立重復(fù)實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示，即M（Q25，Q75），組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝病人群OBI檢出率及S基因MHR突變特點 從10 359例患者中篩選出檢測了血清HBsAg和HBV DNA的患者7323例，其中篩出血清HBsAg陰性及HBV DNA陽性的患者14例，OBI檢出率為0.191%（14/7323）。14例OBI患者中有7例直接測序成功，4例檢出9種HBV S基因MHR突變，其中126-127“RPCMNCTI”插入和F161S為新型變異。見表1。

表1 14例OBI患者基本資料Table 1 Basic information of 14 OBI patients

2.2 穩(wěn)定細(xì)胞株重組HBV S蛋白的Western Blotting鑒定 結(jié)果顯示，Wt產(chǎn)生的HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白由2個條帶組成，即1條27 kD非糖基化條帶（HBsAg分子量24 kD，融合His和myc標(biāo)簽后增加約3 kD）和1條固有s146-148NCT N-糖基化條帶（30 kD，1個N-糖基化修飾使蛋白約增加3 kD），而新增N-糖基化NG融合蛋白顯示3個條帶（33 kD、30 kD、27 kD）（圖1A）。用去糖基化酶PNGase F處理后，所有融合蛋白只剩余1條27 kD的非糖基化條帶（圖1B）。

圖1 細(xì)胞內(nèi)HBsAg-His融合蛋白表達(dá)的Western Blotting分析A.PNGase F處理前各細(xì)胞株目的蛋白表達(dá)情況；B.PNGase F處理后各細(xì)胞株目的蛋白表達(dá)情況；NG.126-127“RPCMNCTI”插入；Mock.空白對照；β-tublin.內(nèi)參Figure 1 Western Blotting analysis of intracellular recombinant HBsAg-His expression

2.3 新增N-糖基化突變對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 在前3個時間點，HepG2-Mock組、HepG2-Wt組和HepG2-NG組的細(xì)胞增殖率無明顯差異（F1=0.748，P=0.513；F2=2.695，P=0.146；F3=1.857，P=0.236），而在后3個時間點尤其是第6時間點，HepG2-NG組細(xì)胞增殖率明顯高于HepG2-Mock組和HepG2-Wt組（F4=12.454，P=0.007；F5=14.451，P=0.005；F6=52.256，P=0.000），而HepG2-Mock組和HepG2-Wt組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2，吸光度與細(xì)胞數(shù)量成正比，吸光度值的增加反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果表明新增N-糖基化突變促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖。

2.4 新增N-糖基化突變對人肝癌HepG2細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕實驗顯示在劃痕后48 h時間點，HepG2-NG組細(xì)胞遷移率明顯高于HepG2-Mock組 和 HepG2-Wt組（P均 ＜ 0.05， 見 圖3A、表2）；細(xì)胞小室遷移實驗結(jié)果顯示，實驗24 h時間點HepG2-NG組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯高于HepG2-Mock組和HepG2-Wt組（P均＜0.05，見圖3B、表2），而HepG2-Mock組和HepG2-Wt組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明新增N-糖基化突變可顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞的遷移能力。

圖2 3組細(xì)胞在不同時間點的增殖率Figure 2 The proliferation rates of cells in 3 groups at different time points

圖3 細(xì)胞劃痕和細(xì)胞小室遷移實驗比較3組細(xì)胞的遷移能力A.通過細(xì)胞劃痕實驗對3組細(xì)胞的傷口愈合能力進(jìn)行分析，比較0～48 h各組細(xì)胞的遷移率，HepG2-NG組明顯增高，顯微鏡下代表性圖片（100×）；B.通過細(xì)胞小室遷移實驗對3組細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的能力進(jìn)行分析，比較各組細(xì)胞24 h時間點穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，HepG2-NG組明顯增多，顯微鏡下代表性圖片（結(jié)晶紫染色，200×）Figure 3 Comparison of migration ability of cells in 3 groups by scratch and transwell assay

2.5 新增N-糖基化突變對人肝癌HepG2細(xì)胞克隆形成能力的影響 通過細(xì)胞平板克隆實驗對3組細(xì)胞接種后貼壁成活并形成克隆的能力進(jìn)行分析，可以比較各組細(xì)胞的克隆形成率。結(jié)果顯示，在6孔板里生長14 d后，HepG2-NG組細(xì)胞克隆形成率明顯高于HepG2-Mock組和HepG2-Wt組（P均＜0.05，見圖4、表3），而HepG2-Mock組和HepG2-Wt組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明新增N-糖基化突變可顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞的克隆形成能力。

表2 48 h時3組細(xì)胞的遷移率及24 h 3組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)Table 2 The migration rate of cells at 48 h and the number of transmembrane cells at 24 h in 3 groups

圖4 平板克隆實驗比較3組細(xì)胞的克隆形成能力Figure 4 Comparison of colony formation ability of cells in 3 groups by colony formation assay

表3 3組細(xì)胞14 d時克隆形成率Table 3 The clonal formation rate of cells in 3 groups at 14 d

2.6 新增N-糖基化突變對HepG2細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，HepG2-NG組處于S期細(xì)胞與HepG2-Mock組和HepG2-Wt組比較明顯增多（P＜0.05，見圖5、表4），而HepG2-Mock組和HepG2-Wt組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），S期細(xì)胞增多表明HepG2-NG組細(xì)胞增殖活躍。

2.7 新增N-糖基化突變對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響 通過DCF熒光值反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量，檢測結(jié)果顯示，HepG2-NG組細(xì)胞中ROS含量的熒光值為（3704.2±103.2），比HepG2-Mock組（2786.5±149.3）和 HepG2-Wt組（2943.4±86.2）明顯增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖6），而HepG2-Mock組和HepG2-Wt組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測比較3組細(xì)胞的細(xì)胞周期Figure 5 Comparison of cell cycle in 3 groups by flow cytometry

OBI呈全球性分布，且在不同人群中都有檢出，如獻(xiàn)血者、接受免疫抑制劑或化療藥物治療者及健康人群等，但肝病人群中OBI的檢出率鮮有報道。OBI與HBV再激活密切相關(guān)，且研究表明OBI可能是HCC發(fā)展的一個危險因素，因此，肝病人群中OBI的檢出率也應(yīng)該受到關(guān)注。

表4 3組細(xì)胞處于S期細(xì)胞所占比例Table 4 The proportion of cells in S phase in 3 groups

圖6 新增N-糖基化突變對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響F=53.694，P=0.000，n=3Figure 6 Effect of additional N-glycosylation mutation on the ROS of HepG2 cells

本研究回顧性分析中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心血清樣本庫中檢測了血清HBsAg和HBV DNA的7323例患者樣本資料，其中篩出OBI患者14例，OBI檢出率為0.191%（14/7323），明顯高于我國獻(xiàn)血員人群OBI檢出率（0.015%～0.097%）[2-3,11]，分析原因可能是本研究中的肝病患者存在一定比例的HBV感染者，發(fā)生病毒變異導(dǎo)致OBI的可能性較大，而獻(xiàn)血員人群一般為健康人群。由于OBI患者的血清HBV DNA載量都偏低，給測序帶來了難度，14例患者中僅有7例測序成功。其中4例檢出9種HBV S基因MHR突變，除126-127“RPCMNCTI”插入和F161S為新型變異外，其余均為已報道的OBI相關(guān)突變。14例OBI患者中有7例HCC（占50%），在測序成功的4例HCC樣本中有3例檢出OBI相關(guān)突變（占75%）。OBI患者中HCC占較高比例，HCC患者中亦有較高的OBI相關(guān)位點突變檢出率，可能預(yù)示著發(fā)生OBI相關(guān)突變與較差的預(yù)后相關(guān)。

N-糖基化是一種重要的蛋白翻譯后修飾方式，可幫助蛋白空間構(gòu)象正確折疊，增加蛋白的穩(wěn)定性和親水性，維持蛋白抗原性[12]，MHR過度糖基化影響蛋白構(gòu)象，掩蓋表面抗原，是病毒逃逸免疫應(yīng)答的重要機(jī)制之一[13]。課題組從1例OBI患者血清中檢出的新型突變126-127“RPCMNCTI”插入發(fā)生了新增N-糖基化突變，且該患者進(jìn)展為HCC。新近的研究顯示突變的HBV蛋白在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上聚集可能引起基因組不穩(wěn)定，從而促進(jìn)HCC發(fā)生[14-15]。本課題組前期研究結(jié)果也顯示新增N-糖基化突變可顯著降低HBsAg的抗原性[16]，且影響病毒分泌，使病毒在細(xì)胞內(nèi)聚集[17]。臨床病例隨訪分析顯示攜帶有新增N-糖基化突變的患者發(fā)生HCC的風(fēng)險增加[18]。但新增N-糖基化突變是否具有直接引起肝細(xì)胞的異常增生與轉(zhuǎn)化的作用尚未見報道。本研究通過細(xì)胞增殖、平板克隆、細(xì)胞劃痕、細(xì)胞小室遷移和細(xì)胞周期等實驗發(fā)現(xiàn)該新增N-糖基化突變可顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力，而且突變株細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高。

綜上所述，該新增N-糖基化突變降低了HBsAg抗原性，導(dǎo)致HBV免疫逃逸從而無法被機(jī)體有效清除，使機(jī)體長期處于隱匿性感染狀態(tài)，包膜蛋白過度N-糖基化修飾錯誤折疊，影響正常分泌，蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引起氧化應(yīng)激使得ROS水平增高，容易造成慢性炎性損傷，而肝細(xì)胞在反復(fù)修復(fù)損傷中增加了細(xì)胞異常增生轉(zhuǎn)化的機(jī)率，這些作用累加最終使得該種突變具有促進(jìn)腫瘤生長的細(xì)胞生物學(xué)特點，從而具有增加慢性HBV感染患者向HCC進(jìn)展的潛在風(fēng)險。

因HepG2細(xì)胞裸鼠成瘤性較差，限制了對N-糖基化突變致瘤性的裸鼠成瘤實驗分析，但本課題組新近又建立了新增N-糖基化突變的Huh7細(xì)胞系，并驗證N-糖基化突變在Huh7細(xì)胞中有相似的致瘤性，后期將通過N-糖基化突變的Huh7細(xì)胞驗證其裸鼠成瘤性，提供更有力的數(shù)據(jù)支持。

總之，本研究表明肝病人群中有較高的OBI檢出率，且新發(fā)現(xiàn)的HBV S基因126-127“RPCMNCTI”插入新增N-糖基化突變在體外細(xì)胞水平（HepG2細(xì)胞）具有促瘤作用，提示新增N-糖基化突變可能是HCC的發(fā)生機(jī)制之一。