基于膳食結(jié)構(gòu)的非酒精性脂肪性肝病動(dòng)物模型

曾慶敏,李 嘉

曾慶敏,天津醫(yī)科大學(xué)研究生院 天津市 300070

曾慶敏,李嘉,天津市第二人民醫(yī)院肝病科 天津市 300192

0 引言

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常見(jiàn)的慢性肝病[1].目前NAFLD的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明,除Day等[2]的“二次打擊”理論外,認(rèn)為其可能還與腸道菌群失調(diào)[3]、固有免疫調(diào)節(jié)紊亂[4]、自噬[5]及表觀遺傳學(xué)[6]等有關(guān).改善飲食結(jié)構(gòu)、減輕體重是預(yù)防和治療NAFLD及其并發(fā)癥最為重要的治療措施[7],臨床上尚缺乏針對(duì)NAFLD的特異性治療方案,當(dāng)前主要集中在二甲雙胍、維生素E、他汀類藥物等胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、抗氧化應(yīng)激及降脂治療[8].因此針對(duì)發(fā)病機(jī)制和相關(guān)治療藥物的研究是目前NAFLD急需攻破的難題.

針對(duì)NAFLD疾病譜的不同階段,可建立相應(yīng)的動(dòng)物模型以模擬其病理生理變化及發(fā)病機(jī)制.迄今為止,已成功構(gòu)建的NAFLD動(dòng)物模型包括鼠、兔、鵪鶉、斑馬魚(yú)等[9],綜合經(jīng)濟(jì)效益、可操作性等因素,鼠模型使用最多,C57BL/6小鼠、Wistar大鼠、Sprague Dawley大鼠這三種株系運(yùn)用最為廣泛.由于膳食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變對(duì)NAFLD的發(fā)生發(fā)展有深遠(yuǎn)影響,本文擬對(duì)不同飲食結(jié)構(gòu)建立的NAFLD動(dòng)物模型作一綜述.

1 高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

膳食脂肪攝入過(guò)多,致循環(huán)游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)含量增加,當(dāng)肝臟攝取脂肪酸比例超過(guò)其分解及輸出時(shí),肝內(nèi)甘油三酯(triglycerides,TG)堆積,從而導(dǎo)致肝臟脂肪變性.NAFLD患者較健康人群顯示明顯升高的循環(huán)FFA及肝內(nèi)脂質(zhì)沉積[10].微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP),存在于肝細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及微粒體內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11],參與甘油三酯的轉(zhuǎn)運(yùn)及極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的裝配與分泌[12].研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食(high fat diet,HFD)喂養(yǎng)的NAFLD大鼠肝臟中MTP表達(dá)減少,導(dǎo)致肝內(nèi)TG轉(zhuǎn)運(yùn)通路障礙,VLDL分泌減少,促進(jìn)肝臟內(nèi)TG沉積,從而導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性[13].HFD可通過(guò)ATP合成減少與線粒體DNA氧化損傷介導(dǎo)的氧化磷酸化缺陷[14]和腸道菌群改變與腸黏膜屏障功能障礙介導(dǎo)的全身慢性低度炎癥反應(yīng)[15]誘導(dǎo)NAFLD.同時(shí),對(duì)NAFLD小鼠肝臟蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與脂肪酸β-氧化、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及碳水化合物合成相關(guān)的蛋白表達(dá)增加,而與膽固醇合成及尿素循環(huán)相關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào)[16].基于以上原理構(gòu)建HFD模型,即飲食配方中脂肪含量占比高(約占膳食總能量的30%-71%).經(jīng)典HFD飲食由脂肪(71%),碳水化合物(11%)和蛋白質(zhì)(18%)組成[17].Lau等[17]予C57BL/6小鼠HFD(45%)12 wk即出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)沉積和肝細(xì)胞脂肪變性等脂肪肝表現(xiàn).而Eccleston等[18]予C57BL/6小鼠經(jīng)典HFD(71%)16 wk,即出現(xiàn)IR、肥胖、脂變、氣球樣變、Mallory小體形成等非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)病理改變.Ichimura等[19]予SD大鼠9 wk HFD(30%)誘導(dǎo)輕度脂肪肝出現(xiàn),18 wk時(shí)可見(jiàn)輕度炎癥,無(wú)纖維化[20];而Lieber等[21]予SD大鼠經(jīng)典HFD飲食3 wk即可表現(xiàn)脂變及小葉內(nèi)炎癥.因此,大鼠較小鼠能更快誘導(dǎo)NAFLD形成;同時(shí),脂肪構(gòu)成及比例不同,造模表現(xiàn)也有差異.反式脂肪酸較豬油誘導(dǎo)更嚴(yán)重的NAFLD病生及病理表現(xiàn)[22,23].飼喂HFD可觀察到明顯的肥胖和IR,模擬人類NAFLD的組織病理學(xué)和發(fā)病機(jī)制;但造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng),肝組織炎癥較輕,纖維化不易形成.Tian等[24]發(fā)現(xiàn)HFD飲食飼養(yǎng)的C57BL/6J小鼠在30 ℃熱中性環(huán)境較22 ℃正常環(huán)境,能加速脂肪組織炎癥的發(fā)展[25].Zarrinpar等[26]發(fā)現(xiàn)限制進(jìn)食時(shí)間(夜間進(jìn)食)可通過(guò)改善腸道菌群的周期性波動(dòng)防止代謝性疾病的進(jìn)展.因此,飼養(yǎng)環(huán)境、喂養(yǎng)方式等也會(huì)影響造模結(jié)果,實(shí)驗(yàn)期間應(yīng)注意保證以上干擾因素的均衡一致性.

2 高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

大量研究表明,體內(nèi)膽固醇代謝紊亂與NAFLD的發(fā)生發(fā)展有關(guān).膽固醇在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽汁酸是膽固醇體內(nèi)代謝的主要途徑,當(dāng)膳食膽固醇攝入增加或代謝減少時(shí),肝內(nèi)膽固醇堆積.過(guò)載的膽固醇可通過(guò)破壞線粒體谷胱甘肽的完整性和改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜膽固醇-磷脂的比率來(lái)觸發(fā)氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化[27].Qian等[28]予Wistar大鼠高膽固醇飲食(high cholesterol diet,HCD)(2%)6 wk即可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性.Matsuzawa等[29]予C57BL/6小鼠HCD(1.25%)12 wk可見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變.Savard等[30]予C57BL/6小鼠HCD(1%)30 wk,表現(xiàn)出輕至中度大泡性脂變及輕度炎癥,無(wú)纖維化形成,而體質(zhì)量較對(duì)照組無(wú)明顯變化.高膽鹽(0.5%)的補(bǔ)充加重脂變及炎癥的進(jìn)展.綜上,盡管高膽固醇模型能誘導(dǎo)肝脂變及炎癥出現(xiàn),但對(duì)體質(zhì)量影響不顯著,不能形成明顯的肥胖及IR,用于模擬人類NAFLD病理生理變化存在一定局限性.

3 高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)關(guān)于高膽固醇飲食與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病關(guān)系的研究較為廣泛,最近幾項(xiàng)研究提出膳食膽固醇在人類與動(dòng)物NAFLD中促進(jìn)肝臟炎癥和NASH進(jìn)展[30-32].Serviddio等[33]予Wistar大鼠高脂(60%)高膽固醇(1.25%)飲食(high fat,high cholesterol diet,HFHC)6 wk即表現(xiàn)出肝內(nèi)脂質(zhì)沉積、肝指數(shù)及肝酶水平增加,同時(shí)伴大泡性脂變、重度肝細(xì)胞氣球樣變及彌漫性炎癥浸潤(rùn).Matsuzawa等[29]予C57BL/6小鼠高脂(60%)高膽固醇(1.25%)飲食24 wk可見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥及纖維化.Savard等[30]發(fā)現(xiàn)HFHC飲食較HFD或HCD,表現(xiàn)出更高的體質(zhì)量增加與肝脂質(zhì)堆積、更明顯的ALT升高和脂聯(lián)素減少,脂肪組織與肝臟炎癥更嚴(yán)重,同時(shí)出現(xiàn)一定程度竇周纖維化,與Matsuzawa等[29]觀點(diǎn)一致.Savard等[30]認(rèn)為膳食高膽固醇的補(bǔ)充通過(guò)減少膽汁酸的合成、VLDL的分泌及脂肪酸的β氧化從而促進(jìn)肝內(nèi)脂質(zhì)超載.有學(xué)者提出膽固醇能通過(guò)Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)-4依賴性途徑激活肝星狀細(xì)胞引發(fā)纖維化[27].HFHC飲食模型,結(jié)合高脂與高膽固醇的優(yōu)劣,既誘導(dǎo)肥胖與IR,又表現(xiàn)出脂變、炎癥、纖維化等病理變化,同時(shí)與我們?nèi)祟愶嬍沉?xí)慣較為一致,較擬合人類NAFLD的疾病譜,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最為廣泛.

4 高果糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

既往流行病學(xué)及臨床研究提示,NAFLD患者果糖攝入量高于健康對(duì)照組,且增加的果糖攝入量與肝細(xì)胞氣球樣變加重、肝臟炎癥及纖維化形成相關(guān)[34].果糖的兩個(gè)主要來(lái)源是蔗糖(由50%果糖和50%葡萄糖組成的二糖)和具有不同果糖含量的高果糖玉米糖漿[35].Bergheim等[36]予30%葡萄糖、果糖、蔗糖等不同糖水喂養(yǎng)C57BL/6小鼠,體質(zhì)量?jī)H在葡萄糖與蔗糖組明顯增加,果糖組增加不明顯,而表現(xiàn)出更多的肝內(nèi)脂質(zhì)沉積、更顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化及更嚴(yán)重的炎癥.同時(shí)只有果糖組顯示門靜脈內(nèi)毒素水平高,他們認(rèn)為果糖可通過(guò)增加細(xì)菌內(nèi)毒素的腸易位促進(jìn)4-羥基壬烯醛、ⅠκB及TNFα等細(xì)胞因子的表達(dá).Schultz等[37]分析單純高脂或高果糖以及兩混合飲食對(duì)肝臟的影響,發(fā)現(xiàn)果糖在未導(dǎo)致肥胖的情況下仍能誘導(dǎo)血脂異常、IR、壞死性炎癥等NASH表現(xiàn).Nigro等[38]比較飽和脂肪和果糖對(duì)肝臟促炎及抗氧化反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)果糖較飽和脂肪更快加速NAFL向NASH進(jìn)展.以上研究提示高果糖攝入能促進(jìn)NAFLD向NASH發(fā)展,同時(shí)誘導(dǎo)纖維化形成,需要注意該模型不能誘導(dǎo)明顯肥胖出現(xiàn),使其在肥胖型NAFLD動(dòng)物模型中的運(yùn)用受到限制.

5 高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

膳食高脂與高果糖在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同促進(jìn)作用已得到廣泛證實(shí).果糖主要由果糖激酶代謝,果糖激酶存在兩種亞型：果糖激酶C和果糖激酶A.果糖激酶C主要存在于肝臟中,是一種快速磷酸化劑,迅速消耗ATP[39],與果糖激酶A相比,與肝脂變關(guān)系更為密切[34].Ishimoto等[39]予野生及己酮糖激酶(KHK-A/C)敲除C57BL/6小鼠分別飼喂低脂(11%)、高脂(36%)、高脂高蔗糖(36%/30%)飲食15 wk,發(fā)現(xiàn)高糖的補(bǔ)充能加重高脂誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性,同時(shí)加速其向NASH及纖維化發(fā)展,并指出果糖主要依賴于果糖激酶而發(fā)揮以上作用.Kohli等[40]予C57BL/6小鼠HFD或高脂高果糖飲食(high fat,high fructose diet,HFHF)飲食,發(fā)現(xiàn)果糖消耗是肝脂質(zhì)沉積向肝纖維化進(jìn)展的必需環(huán)節(jié),盡管體質(zhì)量增加、IR與肝脂變程度在兩組相似,但HFHF組小鼠表現(xiàn)出肝臟氧化應(yīng)激增強(qiáng)、TGF-β與肝CD11b+F4/80+Gr1+巨噬細(xì)胞數(shù)增加以及膠原沉積增多.同時(shí)還指出不同劑型果糖與不同類別脂肪酸的組合將產(chǎn)生不同的肝損結(jié)果.Tsuchiya等[41]予C57BL/6小鼠HFHF飲食2 wk時(shí)即發(fā)現(xiàn)肝臟鐵含量及氧化應(yīng)激的增加,早于4 wk時(shí)出現(xiàn)的肝內(nèi)脂質(zhì)沉積與肝脂變,認(rèn)為HFHF飲食導(dǎo)致的肝鐵離子超載可能與肝脂肪變性和IR相關(guān).以上研究提示HFHF協(xié)同促進(jìn)NAFLD的發(fā)生發(fā)展,且較高脂模型能更快誘導(dǎo)肝纖維化出現(xiàn)且纖維化程度更重,表明果糖是促進(jìn)纖維化形成的啟動(dòng)因子.Liu等[42]發(fā)現(xiàn)喂食野生型TLR4(C3H/HeN WT)小鼠HFHF飲食4 wk、8 wk和16 wk依次出現(xiàn)單純脂肪變性,脂肪性肝炎和肝纖維化.因此運(yùn)用該模型時(shí)需密切關(guān)注造模時(shí)間,準(zhǔn)確掌握藥物干預(yù)時(shí)機(jī),避免造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致肝損程度過(guò)重從而影響早期干預(yù)效果.

6 高脂高膽固醇高果糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

西方飲食或快餐飲食,由脂肪、膽固醇及果糖組成,被認(rèn)為是導(dǎo)致肥胖的危險(xiǎn)因素.Kanuri等[43]以高脂(25%)高膽固醇(0.2%)高果糖(50%)飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠6 wk即出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性、內(nèi)毒素水平增加及明顯炎癥反應(yīng).Charlton等[44]予C57BL/6小鼠快餐飲食(40%脂肪+2%膽固醇+果糖)6 mo,表現(xiàn)出肥胖、IR、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激、明顯氣球樣變與炎癥以及進(jìn)展性纖維化.高脂高膽固醇高果糖飲食,現(xiàn)代都市人群喜食膨化食品和喜飲碳酸飲料的體現(xiàn),模擬西方飲食結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)肥胖與IR出現(xiàn)的同時(shí),較前幾種模型誘導(dǎo)炎癥與纖維化出現(xiàn)的時(shí)間更短、更迅速,范圍更廣、更嚴(yán)重.運(yùn)用該模型探索NAFLD的發(fā)病機(jī)制顯示出較好的優(yōu)勢(shì),但用于尋找藥物治療靶點(diǎn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格把握飼喂時(shí)間,避免造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的不可逆性肝損害.

表1 非酒精性脂肪性肝病飲食動(dòng)物模型

7 蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

基于“二次打擊”學(xué)說(shuō),蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(methionine and choline deficient diet,MCD)模型已被廣泛用于NASH與纖維化等NAFLD嚴(yán)重表型的研究.MCD飲食包含蔗糖(40%)與脂肪(10%),但缺乏蛋氨酸與膽堿.蛋氨酸與膽堿是磷脂酰膽堿的前體[12],作為合成VLDL的原料,飲食蛋氨酸與膽堿的缺乏將影響VLDL的合成與分泌,從而導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)堆積、脂質(zhì)過(guò)氧化、肝脂肪變性、氧化應(yīng)激損傷、壞死性炎癥等.Sahai等[45]以MCD喂養(yǎng)A/J小鼠,1 wk即出現(xiàn)肝脂變,2 wk即可見(jiàn)炎癥,8 wk時(shí)纖維化已形成.Weltman等[46]以MCD喂養(yǎng)Wistar大鼠,4 wk即出現(xiàn)大泡性脂變與炎癥浸潤(rùn).與其他飲食模型相比,在相同喂養(yǎng)時(shí)間內(nèi),MCD喂養(yǎng)SD大鼠[47]、Wistar大鼠[48]或C57BL/6小鼠[49]表現(xiàn)出更高水平的ALT與細(xì)胞因子數(shù),更嚴(yán)重的脂變、氣球樣變、炎癥壞死及纖維化,更活躍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體氧化應(yīng)激.且不同物種、種系[43]及性別[50]對(duì)MCD的反應(yīng)也不同.MCD模型誘導(dǎo)NAFLD演變進(jìn)展較高脂或其它模型更快更嚴(yán)重,且更能模仿人類嚴(yán)重的NASH的病理學(xué)改變[17].然而,MCD模型雖在短時(shí)間內(nèi)即可誘導(dǎo)NASH等嚴(yán)重表型的出現(xiàn),但尚未表現(xiàn)外周IR及肥胖[51],反而出現(xiàn)嚴(yán)重體質(zhì)量下降、惡病質(zhì)及低血清胰島素、瘦素和甘油三酯水平,與人類NAFLD代謝譜明顯不同,因此該模型的應(yīng)用存在一定程度局限性,當(dāng)前主要用于NASH炎癥與纖維化形成機(jī)制的探討與治療藥物的篩選研究.

8 膽堿缺乏性左旋氨基酸飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型

膽堿缺乏性左旋氨基酸(choline-Deficient l-Amino-Defined Diet,CDAA)飲食與MCD飲食相似,均缺乏膽堿;與膽堿缺乏飲食除蛋白質(zhì)被等量L-氨基酸混合物取代外,其余總體組成相同[52].CDAA飲食可誘導(dǎo)小鼠形成肝細(xì)胞脂變、炎癥及纖維化,所需時(shí)間較MCD飲食稍長(zhǎng)[53].與MCD飲食相似,CDAA飲食喂養(yǎng)的小鼠不能出現(xiàn)IR與肥胖[54],因此,用于研究代謝性特征尚存在缺陷.遂有學(xué)者提出CDAA飲食與HFD飲食結(jié)合的高脂型CDAA飲食,然而,HFD的添加仍未誘導(dǎo)C57BL/6J和A/J兩種小鼠出現(xiàn)代謝相關(guān)特征,但發(fā)現(xiàn)6 wk即可誘導(dǎo)C57BL/6J纖維化形成[55].此外,長(zhǎng)時(shí)間的CDAA飲食可用于構(gòu)建肝臟惡性腫瘤模型[56](表1).

9 結(jié)論

基于膳食結(jié)構(gòu)對(duì)NAFLD的影響,本文主要探討飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型,包括高脂、高膽固醇、高果糖以及MCD.構(gòu)建單純脂肪肝模型,高脂或高膽固醇飲食尚可,而NASH及肝纖維化等模型的建立,尚需考慮膽固醇、果糖和膽堿或MCD.上述飲食動(dòng)物模型尚不能單獨(dú)用于模擬完整的NAFLD疾病發(fā)展譜,因在不同生理或病理方面各模型間各有優(yōu)勢(shì),優(yōu)劣互補(bǔ),對(duì)探索NAFLD的發(fā)病機(jī)制及尋找藥物治療靶點(diǎn)仍具有重要指導(dǎo)意義.同時(shí),尚需關(guān)注造模時(shí)間、動(dòng)物種系等因素的影響.不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案下針對(duì)性地選擇最合適的動(dòng)物模型用于NAFLD發(fā)病機(jī)制與藥物靶點(diǎn)的研究至關(guān)重要.