長鏈非編碼RNA MALAT1在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義:基于多基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫分析

倪雅懿,薛麗華,張 培,朱廣博

倪雅懿,薛麗華,張培,朱廣博,天津市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 天津市 300121

0 引言

大腸癌是全世界范圍內(nèi)最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,也是腫瘤相關(guān)死亡的重要原因.2015年我國常見腫瘤的流行病調(diào)查顯示,當(dāng)年我國大腸癌新發(fā)病例為376300例,因大腸癌死亡的人數(shù)為19100例,大腸癌已成為我國居民死亡的重要原因之一[1].隨著環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變,我國結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)的發(fā)病率和死亡率分布具有以下特點(diǎn)：男性高于女性,城市高于農(nóng)村,發(fā)病率和死亡率均隨年齡增長而上升.大腸癌患者早期行根治術(shù),預(yù)后較好,5年生存率較高,而晚期已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后較差.因此,探尋CRC侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)成為研究熱點(diǎn).

近年來大量文獻(xiàn)報道,長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,LncRNA)在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡衰老及腫瘤發(fā)生、發(fā)展調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[2,3].LncRNA MALAT1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)是近年來研究的較多的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子.其在肺腺癌中高表達(dá)并與肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān).而MALAT1在大腸癌中的表達(dá)情況及其臨床意義鮮有報道.

1 材料和方法

1.1 材料 MALAT1為近年來發(fā)現(xiàn)的LncRNA,既往研究認(rèn)為其與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān).我們首先在BioGPS(http：//biogps.org/#goto=welcome)數(shù)據(jù)庫中分析人類正常腸上皮組織中MALAT1的表達(dá)情況;然后在腫瘤基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)庫Oncomie(https：//www.oncomine.org/)中分析大腸癌組織與正常腸上皮是否存在MALAT1的差異表達(dá)(薈萃分析多個基因芯片數(shù)據(jù));同時根據(jù)高、低表達(dá)分為2組,并計(jì)算MALAT1高表達(dá)與低表達(dá)組有無生存期差異,數(shù)據(jù)來源與Kaplan-Meier Plotter(http：//kmplot.com/analysis/);最后應(yīng)用蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫STRING(https：//string-db.org/cgi/input.pl)預(yù)測MALAT1可能相互作用的蛋白及共表達(dá)情況.

1.2 方法

1.2.1 BioGPS數(shù)據(jù)庫：在BioGPS數(shù)據(jù)庫中輸入MALAT1,檢索出人體大部分組織中MALAT1的相對表達(dá)量.

1.2.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫：Oncomie數(shù)據(jù)庫檢索MALAT1基因,分析MALAT1基因在人體腫瘤與對應(yīng)的正常組織中的相對表達(dá)情況.設(shè)置條件為：(1)大腸癌(colorectal carcinoma/colon cancer/rectal cancer);(2)標(biāo)本來源為手術(shù)切除標(biāo)本;(3)組織對比為大腸癌組織與正常腸上皮組織;(4)數(shù)據(jù)類型為mRNA;(5)顯著性P值＜0.0001;(6)表達(dá)差異為基因上調(diào)或下調(diào)大于2倍;(7)基因排序?yàn)榍?0%.

1.2.2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫：在該數(shù)據(jù)總根據(jù)MALAT1在癌及正常組織中的總體中位表達(dá)水平分為高、低表達(dá)組.應(yīng)用生存曲線,分析兩組的總生存有無差異.

1.2.3 String 數(shù)據(jù)庫蛋白相互作用分析：在該數(shù)據(jù)庫中,對MALAT1蛋白相關(guān)的蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,篩選條件為相關(guān)性大于0.9.同時進(jìn)行共表達(dá)分析,繪制共表達(dá)和相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)分析采用STATA 10.0軟件完成,計(jì)量資料應(yīng)用mean±SD表示,應(yīng)用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)采用率表示,應(yīng)用chi-square檢驗(yàn);生存分析首先繪制生存曲線,并采用log-rank檢驗(yàn),P＜0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 MALAT1基因mRNA在腫瘤與正常組織差異表達(dá) BioGPS數(shù)據(jù)庫分析正常結(jié)直腸組織中MALAT1的相對表達(dá)情況.MALAT1在正常結(jié)直腸組織中的相對表達(dá)量較低(圖1).Oncomine數(shù)據(jù)庫中,LncRNA MALAT1基因mRNA腫瘤：正常組織表達(dá)研究220項(xiàng),其中高表達(dá)13項(xiàng),低表達(dá)13項(xiàng).大腸癌中差異表達(dá)的研究8項(xiàng),其中6項(xiàng)在腸癌中高表達(dá),2項(xiàng)低表達(dá)(圖2A和表1).比較大腸癌與對應(yīng)正常組織的相關(guān)芯片數(shù)據(jù)為18個(來自9項(xiàng)研究[4-12]),整體分析顯示,大腸癌組織中MALAT1表達(dá)水平顯著高于正常組織(P= 0.027)(圖2B).按結(jié)腸癌與直腸癌進(jìn)亞組分析,結(jié)腸癌組織與正常組織MALAT1表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P= 0.149)(圖2C).而直腸癌組織中MALAT1表達(dá)水平明顯高于對應(yīng)正常組織(P= 1.04 E-5)(圖2D).

2.2 MALAT1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系 在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺中分析大腸癌患者M(jìn)ALAT1高低表達(dá)與患者生存期的關(guān)系,MALAT1高、低表達(dá)組總生存期分別為41.93 mo和52.2 mo,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR = 0.64,95%CI：0.29-1.39,P= 0.25)(圖3).

2.3 MALAT1可能相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò) 在String數(shù)據(jù)庫中分析與MALAT1可能相互作用的蛋白,結(jié)果顯示MALAT1與TP53,SUZ12,CDK4,KDMA,等具有相互作用關(guān)系(圖4).上述相互作用蛋白包括多梳蛋白家族,周期蛋白依賴性蛋白激酶等,與腫瘤的基因表達(dá)控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞分裂有關(guān).共表達(dá)分析顯示MALAT1蛋白與EZH2,TP53,SRSF1等基因具有共表達(dá)關(guān)系(圖5),提示這些基因在功能上可能具有相似性.

3 討論

lncRNA是一類長度大于200nt的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本,曾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”.最初被認(rèn)為由于其不具備開放閱讀框ORF無法被進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)而無生物學(xué)功能,是轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)品.然而隨著研究的深入,越來越多的報道認(rèn)為lncRNA可參與調(diào)控許多重要的生物學(xué)過程,包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、多能干細(xì)胞重編程等[13].目前認(rèn)為lncRNA的作用機(jī)制主要有：轉(zhuǎn)錄并招募相關(guān)因子干擾蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá);通過組蛋白修飾等介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu),從而影響下游基因的表達(dá);通過與mRNA形成互補(bǔ)雙鏈對轉(zhuǎn)錄后的mRNA進(jìn)行選擇性剪接;作為內(nèi)源性siRNA發(fā)揮作用;通過與相關(guān)蛋白相互作用,調(diào)節(jié)其定位和/或其分子結(jié)構(gòu)從而影響其活性[14-17].

表1 MALAT1基因mRNA在大腸癌組織與正常組織差異表達(dá)

圖1 BioGPS數(shù)據(jù)庫分析正常結(jié)直腸組織中MALAT1的相對表達(dá)情況.

MALAT1是較早發(fā)現(xiàn)的一類與轉(zhuǎn)錄本加工有關(guān)的lncRNA.2003年Ji等[18]在對非小細(xì)胞肺癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)移患者的組織中MALAT1表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移組織.此后的功能學(xué)研究顯示,MALAT1由DNA轉(zhuǎn)錄后的3’端加工而來,其主要位于剪切斑點(diǎn)附近[19].MALAT1可與絲氨酸/精氨酸(Ser/Arg)剪接因子間存在相互作用,并還通過調(diào)控剪接因子在剪接斑點(diǎn)中的分布和磷酸化水平,使mRNA前體的選擇性剪接模式發(fā)生改變從而達(dá)到調(diào)控轉(zhuǎn)錄本剪接模式的分子生物學(xué)功能.MALAT1被認(rèn)為是與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要lncRNA.在肺癌轉(zhuǎn)移病灶中,MALAT1的表達(dá)水平顯著增高,因而推測其與肺癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān).

MALAT1在肺癌中的研究較多,且大多數(shù)研究認(rèn)為MALAT1高表達(dá)與肺癌的惡性生物學(xué)行為及預(yù)后不良有關(guān)[20-22].但MALAT1在腸癌中的表達(dá)情況及其與患者的預(yù)后關(guān)系報道并不多見,且各研究的結(jié)論也并不完全一致.楊孜歡等[23]人分析了LncRNA MALAT1表達(dá)與CRC侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系,結(jié)果認(rèn)為MALAT1低表達(dá)與CRC侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并且這一相關(guān)性是通過調(diào)控Rac1b的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的.而姚坤厚等[24]人的研究認(rèn)為CRC中異常高表達(dá)的MALAT1可促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲,該功能可能是通過調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的.上述兩個研究在MALAT1在腸癌中的表達(dá)水平方面得出了相反的結(jié)論.因此,在本研究中,我們對多個數(shù)據(jù)庫中關(guān)于MALAT1在腸癌中的表達(dá)情況及臨床意義進(jìn)行了深入挖掘,以期明確MALAT1在腸癌中的真實(shí)表達(dá)情況.研究結(jié)果認(rèn)為,大腸癌組織中MALAT1基因表達(dá)表達(dá)水平明顯上調(diào),但MALAT1表達(dá)水平與患者預(yù)后并無相關(guān)性.MALAT1蛋白與TP53,SUZ12,CDK4,KDMA蛋白相互作用,上述相互作用蛋白包括多梳蛋白家族,周期蛋白依賴性蛋白激酶等,與腫瘤的基因表達(dá)控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞分裂有關(guān).本研究為進(jìn)一步分析MALAT1在腸癌中的表達(dá)、生物學(xué)功能及與其他基因相互作用的信號通路提供了依據(jù).同時也在一定程度上證實(shí)MALAT1作為大腸癌預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性不強(qiáng).

圖2 MALAT1 mRNA在大腸癌與正組織中的差異表達(dá)薈萃分析.

圖3 MALAT1基因表達(dá)水平與大腸癌患者預(yù)后的生存曲線.

圖4 MALAT1與-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖.

圖5 MALAT1基因共表達(dá)情況.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

長鏈非編碼RNA(Long-chain non-coding RNA,LncRNA)在腫瘤中的作用為近年研究熱點(diǎn),MALAT1在結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)中的表達(dá)及其相關(guān)分子生物學(xué)功能不清.其與患者預(yù)后關(guān)系仍存有爭議.因此,我們采用生物信息學(xué)方法,探討MALAT1在CRC患者癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)、相關(guān)信號通路及與患者的關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

本文通過分析基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)庫中關(guān)于MALAT1表達(dá)與CRC的關(guān)系,明確其在CRC患者組織中的表達(dá)、相關(guān)信號通路及與預(yù)后的相關(guān)性.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

明確LncRNA在腸癌中的差異表達(dá),MALAT1在腸癌發(fā)生中的信號通路相關(guān)蛋白及其在患者預(yù)后評價中的作用.

實(shí)驗(yàn)方法

BioGPS數(shù)據(jù)庫分析正常腸上皮中MALAT1的表達(dá)情況.然后再Oncomine數(shù)據(jù)庫中綜合分析大腸癌組織與正常腸上皮組織MALAT1的差異表達(dá),并分析MALAT1高、低表達(dá)與患者生存期是否存在相關(guān)性.應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫中蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析與MALAT1相互作用及共表達(dá)的相關(guān)信號通路蛋白.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大腸癌組織中MALAT1表達(dá)水平顯著高于正常組織.MALAT1高、低表達(dá)組總生存期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.MALAT1與TP53,SUZ12,CDK4,KDMA,等具有相互作用關(guān)系而與EZH2,TP53,SRSF1等基因具有共表達(dá)關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

CRC患者癌組織中MALAT1基因表達(dá)表達(dá)水平明顯上調(diào),但與患者預(yù)后并無明顯相關(guān)性.MALAT1與TP53,SUZ12,CDK4,KDMA蛋白相互作用并與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及分裂有關(guān).

展望前景

MALAT1高低表達(dá)是否有腸癌患者預(yù)后相關(guān)仍存有爭議,需要高質(zhì)量前瞻性研究進(jìn)行證實(shí).MALAT1具體調(diào)控腸癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有待相關(guān)分子生物學(xué)研究進(jìn)一步驗(yàn)證.