采用植物代謝組學(xué)技術(shù)檢測不同產(chǎn)地甘草活性成分的含量

劉 謙，李 熙

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保定分中心，河北 保定071000)

甘草為豆科甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根莖，是常用的中藥材，性甘，味平，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1-6]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對甘草屬植物進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，發(fā)現(xiàn)其主要有效成分是黃酮類和三萜皂苷成分，還有少量的生物堿、木質(zhì)素和香豆素等[7-10]?！吨袊幍洹?015 版一部對甘草藥材的性狀、甘草苷及甘草酸含量采用了顯微鑒別、薄層色譜鑒別等檢測，以進(jìn)行質(zhì)量控制。通過對不同栽培年齡不同產(chǎn)地的甘草進(jìn)行比較，無論黃酮還是皂苷類成分含量都有較大差異，有些成分含量甚至差異很大。雖然采用HPLC法能對甘草化學(xué)成分進(jìn)行較好的分離，但其主要用于對甘草酸等特定成分進(jìn)行分析和檢測。由于植物代謝產(chǎn)物種類繁多、結(jié)構(gòu)迥異，傳統(tǒng)的分析手段難以滿足高通量分析的要求，代謝組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為這一問題的解決提供了新的方案。代謝組學(xué)技術(shù)是近十年來發(fā)展較快的新興組學(xué)技術(shù)，可對生物或細(xì)胞內(nèi)所有小分子代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，是系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要手段。與傳統(tǒng)的化學(xué)分離模式相比，代謝組學(xué)技術(shù)可最大程度揭示中藥化學(xué)成分間的協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)技術(shù)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法對不同產(chǎn)地甘草的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，以中藥的整體觀和多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)為切入點(diǎn)，充分考慮中藥內(nèi)部化學(xué)成分的變化，開展綜合質(zhì)量技術(shù)評價(jià)，為甘草的規(guī)范化種植提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器和材料

島津LC-20A高效液相色譜儀，包括SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-20AT二元梯度泵，帶PDA的SPD-M20A型紫外檢測器；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)；流動(dòng)相所用乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 樣品處理

取甘草粉末(過3號篩)約0.2 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)35 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18不銹鋼柱，4.6 mm×250 mm，5 μm 粒徑。流動(dòng)相：梯度洗脫。乙腈：0.05%磷酸溶液/(19-81)至(19-81)，0～8 min；(19-81)至(50-50)，8～35 min；(50-50)至(100-0)，35～36 min；(100-0)至(19-81)，36～40 min。柱溫：35 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：全離子掃描；離子源溫度：120 ℃。

2 檢測結(jié)果

以乙腈、0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行線性梯度洗脫可得到較好的高效液相色譜分離效果。在全離子掃描方式下，三萜皂甙、黃酮和香豆素化合物作為甘草中的主要化學(xué)成分，其分子中的羥基易形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子，在負(fù)離子電噴霧的環(huán)境下得到的質(zhì)譜圖(圖1)。由圖1可知，不同類型的化合物其離子響應(yīng)值有很大的不同。

圖1 甘草樣品的全離子掃描

三萜皂甙、黃酮和香豆素化合物作為甘草中的主要化學(xué)成分，表現(xiàn)出的光譜和質(zhì)譜特征有很大的區(qū)別。黃酮類化合物從結(jié)構(gòu)上來看，準(zhǔn)分子離子[M+ Cl]-、[M-H]-和[M+ 97]-非常明顯，通過對其結(jié)構(gòu)的分析可判斷出，[M+ 97]-是[M+ HSO4]-，這可輔助分子量的確證。在樣品的濃度比較高的條件下，[2M-H]-也有可能形成。這些準(zhǔn)分子離子是確定該類化合物結(jié)構(gòu)的重要途徑。香豆素類化合物與黃酮的準(zhǔn)分子離子峰產(chǎn)生的途徑比較類似，[M+ Cl]-、[M-H]-和[M+ HSO4]-出現(xiàn)的概率大。而在三萜皂甙類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖醛酸，產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子也有明顯的結(jié)構(gòu)特征。通過對光譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，對甘草分離出的80余個(gè)主要峰進(jìn)行分析，大致確定了40個(gè)主要成分的可能結(jié)構(gòu)。鑒定出的化合物的名稱、紫外最大吸收、準(zhǔn)分子離子峰分析，見表1。

續(xù)表1 甘草中的40種主要化學(xué)成分

甘草的質(zhì)量取決于其物質(zhì)基礎(chǔ)，通過對甘肅、新疆、內(nèi)蒙、寧夏四地的甘草樣品進(jìn)行檢測，對比檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甘肅、寧夏的西北甘草多含甘草酸、甘草甙、異甘草甙、甘草香豆酮、異甘草黃酮醇、甘草異黃酮甲、甘草黃酮醇、甘草豆精-7-甲醚、甘草西定、甘草利酮、甘草寧F、G、H、I、甘草酚等；新疆甘草含甘草酸、甘草甙、異甘草甙、刺芒柄花素、甘草異黃酮B、甘草素、甘草西定等；內(nèi)蒙、吉林的東北甘草含甘草酸、甘草甙、異甘草甙、甘草香豆酮、甘草西定、甘草利酮、甘草酚等。本研究通過檢測甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素六種主要的化學(xué)成分含量，對不同產(chǎn)地的甘草進(jìn)行了測定。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取甘草苷對照品 14.8 mg、甘草酸銨對照品 21.2 mg、甘草素對照品18.9 mg、異甘草素17.3 mg、芹糖甘草苷21.0 mg，分別用70%乙醇定容于10 mL 容量瓶中，另稱取芹糖異甘草苷4.8 mg，用70%乙醇定容于5 mL容量瓶中，作為對照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取甘草苷儲(chǔ)備液67.6 μL、甘草酸銨儲(chǔ)備液47.2 μL、甘草素儲(chǔ)備液52.9 μL、異甘草素儲(chǔ)備液57.8 μL、芹糖甘草苷儲(chǔ)備液47.6 μL、芹糖異甘草苷104.2 μL，用70%乙醇定容至1 mL，作為系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣10 μL，記錄甘草苷、甘草酸銨、甘草素、異甘草素、芹糖甘草苷和芹糖異甘草苷的峰面積，以峰面積對進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)系列色譜圖，見圖2。甘草苷、甘草酸銨、甘草素、異甘草素、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷色譜峰理論塔板數(shù)，分別為9千、30萬、6萬、20萬、7千、1萬。

表2 不同產(chǎn)地甘草中甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖 甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素的含量比較 (mg/g)

續(xù)表2 不同產(chǎn)地甘草中甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖 甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素的含量比較 (mg/g)

2.2 穩(wěn)定性和精密度實(shí)驗(yàn)

取甘肅甘草樣品一份，按照“1.2”項(xiàng)下方法取得供試品溶液，室溫放置，并于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各物質(zhì)的峰面積進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取甘肅甘草樣品6份，按照“1.2”項(xiàng)下方法取得供試品溶液，同樣實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各物質(zhì)的峰面積，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。

六種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在上述儀器條件下，在5～30 min全部出峰且峰形尖銳而對稱，測試結(jié)果見圖2至圖6。圖2表示的是六種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰的先后順序色譜，圖3至圖6分別是甘肅、新疆、內(nèi)蒙、寧夏的甘草樣品的色譜。表2為六種主要成分的檢測結(jié)果。由穩(wěn)定性測試結(jié)果可知，甘草供試品各色譜峰相對保留時(shí)間在12 h內(nèi)穩(wěn)定。由精密度實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果可知，精密度均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

圖2 甘草酸、甘草苷、異甘草素、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素六種物質(zhì)色譜

圖3 甘肅甘草樣品的色譜

圖4 新疆甘草樣品的色譜

圖5 內(nèi)蒙甘草樣品的色譜

圖6 寧夏甘草樣品的色譜

3 討論

在測定樣品中，吉林甘草樣品中甘草酸、甘草苷、異甘草素普遍較低，內(nèi)蒙、甘肅、新疆甘草樣品中甘草酸含量較高，而新疆甘草樣品甘草酸含量最高，甘草苷的含量以內(nèi)蒙和甘肅甘草樣品為高，異甘草素含量以內(nèi)蒙甘草樣品為高。新疆和內(nèi)蒙的樣品中芹糖甘草苷含量明顯高于甘肅和吉林的樣品，而甘肅和吉林中芹糖甘草苷含量比較接近，新疆和內(nèi)蒙的樣品中芹糖甘草苷含量比較接近。新疆樣品中的甘草素含量最高，明顯高于其他三地；內(nèi)蒙和吉林樣品的甘草素含量接近，甘肅樣品中甘草素含量最低。四地的芹糖異甘草苷含量相差不大，吉林和甘肅兩地的樣品更為接近。由此可見，在選定的六種物質(zhì)中，東北、華北、西北不同產(chǎn)地的甘草樣品其含量差異很大，并且表現(xiàn)出一定的規(guī)律性和代表性。除此之外，其他甘草的活性成分由于不同地理位置、生長環(huán)境、氣候條件、種植方式的差異，也呈現(xiàn)出相似的特征。這些都可以作為中藥材產(chǎn)地鑒別的參考，可為甘草的規(guī)范化種植提供一定的科學(xué)依據(jù)。