HPLC法測定降糖益腎丸中毛蕊花糖苷的含量

謝 瑜，雷 昌，王 青*，梁曉嵐，鄒菊英

(1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學/湖南省中藥粉 體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

降糖益腎丸為湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院用于治療糖尿病腎病的常用院內(nèi)自制中藥，該藥控制糖尿病腎病早期癥狀療效確切，在多年臨床應用中無明顯不良反應，安全可靠。降糖益腎丸由生地、山藥、益母草、黃芩等多味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、瀉火解毒的功效[1]。方中生地為君藥，現(xiàn)代化學和藥理學研究表明，生地藥材的化學成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、紫羅蘭酮類、糖類等，其中苯乙醇苷類代表性化合物毛蕊花糖苷，具有抗氧化、腎功能保護、免疫調(diào)節(jié)、抗細胞凋亡等作用[2-3]。

目前降糖益腎丸質(zhì)量標準僅采用薄層色譜法對部分藥味進行鑒別，專屬性較低，缺少方中有效成分的含量控制。為了控制降糖益腎丸的質(zhì)量，確保用藥安全有效，亟需提高該藥的質(zhì)量標準。因此，本研究以毛蕊花糖苷為檢測指標，采用HPLC法對其進行含量測定，以期進一步完善降糖益腎丸的質(zhì)量標準。

1 儀器與材料

Agilent 1260 LC(安捷倫科技有限公司)；Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；電子分析天平T-214(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

降糖益腎丸由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)提供(批號：20170901、20170912、20170924)。毛蕊花糖苷對照品(批號：111530-201713)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，實驗用水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品適量，置100 mL量瓶中，加無水甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后制成每1 mL中含毛蕊花糖苷30.4 μg的對照品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取其續(xù)濾液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品細粉約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，50 ℃溫浸2 h，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)提取30 min，濾過，減壓回收提取液至干，殘渣加無水甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 除去生地的降糖益腎丸處方飲片，按處方比例和工藝要求制成缺生地的降糖益腎丸陰性樣品，再按上述供試品溶液制備項下的方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；檢測波長為280 nm；流動相：A為乙腈，B為0.2%磷酸溶液，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫條件

按照擬定的色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定并記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜圖在與對照品色譜圖相應保留時間處，有一相同的色譜峰，而陰性樣品溶液未見該峰，表示無陰性干擾成分。供試品色譜峰的分離度、拖尾因子、理論板數(shù)均能達到系統(tǒng)適應性要求，結(jié)果見圖1。

2.3 毛蕊花糖苷的線性關(guān)系考察

按照擬定的色譜條件，精密吸取上述“2.1”項下的毛蕊花糖苷對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL進樣，測定峰面積，以對照品進樣量X為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，求得其回歸方程為：Y=0.879 7X+4.079 8，r=0.999 7，表明毛蕊花糖苷在60.8～364.8 ng質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

A.毛蕊花糖苷對照品；B.降糖益腎丸供試品；C.降糖益腎丸陰性樣品

圖1 降糖益腎丸中毛蕊花糖苷的HPLC色譜

2.4 精密度試驗

精密吸取“2.1”項下的同一批號(20170912)降糖益腎丸供試品溶液，在上述HPLC條件下，連續(xù)進樣6次，記錄毛蕊花糖苷峰面積，計算求得其RSD值為0.92%。結(jié)果表明，該方法的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一批號降糖益腎丸供試品溶液，在上述色譜條件下，常溫時分別于制備后0、2、4、8、12、24h依次進樣測定，記錄毛蕊花糖苷的峰面積值，計算其RSD值為0.92%。結(jié)果表明，降糖益腎丸樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性試驗

稱取降糖益腎丸同一批樣品(批號：20170912)約10 g，共6份，精密稱定，按上述“2.1”項下方法制成供試品溶液，在所確定的色譜條件下分別測定毛蕊花糖苷的含量，計算其平均含量為0.039 0 mg/g，RSD為0.95%，結(jié)果表明，該測定方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的降糖益腎丸細粉(批號：20170912，毛蕊花糖苷含量為0.039 0 mg/g)約10 g，精密稱定6份，分別精密加入30.4 μg/mL毛蕊花糖苷對照品溶液10 mL(相當于0.304 mg)，按上述“2.1”項下方法制成供試品溶液進樣測定，計算毛蕊花糖苷含量、回收率和RSD值，結(jié)果平均回收率為97.56%，RSD為1.04%。見表2。

2.8 樣品含量測定

取3批降糖益腎丸樣品(批號：20170901，20170912，20170924)按照上述“2.1”項下的方法制備成樣品溶液。在所確定的色譜條件下，測定毛蕊花糖苷含量，測得3批降糖益腎丸樣品中毛蕊花糖苷含量分別為0.039 0 mg/g、0.038 9 mg/g、0.039 9 mg/g。

3 討論

本實驗采用不同比例提取溶劑(50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇) 超聲提取，結(jié)果表明100%甲醇提取的供試品溶液進入液相后其他成分的干擾大，結(jié)果見圖2。

表2 回收率試驗結(jié)果

圖2 降糖益腎丸的HPLC色譜

采用50%甲醇溶液、75%甲醇溶液則可避開多雜質(zhì)出峰，為提高提取效率，選擇75%甲醇溶液超聲提??；考慮到降糖益腎丸為全生藥粉制丸的口服固體制劑，故超聲提取前于50 ℃溫浸2 h有利于有效成分充分溶出。

目前國內(nèi)外現(xiàn)代醫(yī)學對糖尿病腎病治療主要采取控制血糖、血壓及抗腎病對癥處理，尚無滿意的防治方法，藥物僅能改善患者相關(guān)癥狀，存在易復發(fā)、副作用大等缺點[4]。中醫(yī)理論指導下應用復方中藥治療糖尿病腎病具有作用溫和、療效持久、毒副作用小的優(yōu)勢[5]，但其復雜的成分體系使得其藥效物質(zhì)基礎研究困難。因此，本研究通過高效液相法測定降糖益腎丸中毛蕊花糖苷的含量，不僅為本制劑的質(zhì)量標準提供依據(jù)，同時對于降糖益腎丸抗糖尿病腎病的物質(zhì)基礎研究具有重要意義。