土壤DNA提取技術(shù)在本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

李亮　武洪慶　郭子渝　崔忠信　胡海誠(chéng)

摘 要 開(kāi)展科研訓(xùn)練、提高學(xué)生科學(xué)素養(yǎng)，一直是本科教學(xué)改革研究熱點(diǎn)之一。以課題組常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)“土壤DNA提取”為基礎(chǔ)，結(jié)合“大學(xué)生科技創(chuàng)新”等活動(dòng)，設(shè)計(jì)綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，對(duì)可能參與課題組科研工作的學(xué)生進(jìn)行選拔和培訓(xùn)。綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)提高了學(xué)生的科研能力、訓(xùn)練了學(xué)生的科研思維，使學(xué)生順利的參與到教師的科研工作中，實(shí)現(xiàn)了教學(xué)與科研的相互融合。

關(guān)鍵詞 微生物DNA提取 教學(xué)與科研融合 創(chuàng)新

中圖分類號(hào)：G424 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2019.06.056

Application of Soil DNA Extraction Technology in

Undergraduate Teaching Experiment

LI Liang， WU Hongqing， GUO Ziyu， CUI Zhongxin， HU Haicheng

（College of Chemical Engineering and Technology， Hebei University of Technology， Tianjin 300130）

Abstract Developing scientific research training and improving students' scientific literacy has always been one of the hotspots in undergraduate teaching reform. Based on the experimental technology "soil DNA extraction" commonly used by the research group and combined with the activities of "scientific and technological innovation of College students"， comprehensive innovation experiments were designed to select and train students who might participate in the research work of the research group. Comprehensive innovation experiment improves students' scientific research ability， trains students' scientific research thinking， makes students participate in teachers' scientific research work smoothly， and realizes the integration of teaching and scientific research.

Keywords microbial DNA extraction； integration of teaching and scientific research； innovation

在本科生的培養(yǎng)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有重要的意義。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)可以在預(yù)期的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)學(xué)習(xí)基本實(shí)驗(yàn)方法、規(guī)范基本實(shí)驗(yàn)操作、檢驗(yàn)?zāi)骋焕碚摶蛟淼饶康?。然而，這只是一種基礎(chǔ)普眾性教學(xué)，處于實(shí)驗(yàn)教學(xué)的初級(jí)階段。其“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力缺失”“與科研結(jié)合不緊密”“學(xué)生動(dòng)腦少、缺乏主動(dòng)性”等缺點(diǎn)使傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到培養(yǎng)具備高水平實(shí)驗(yàn)技能優(yōu)秀人才的目的。近年來(lái)，很多高校開(kāi)展實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，構(gòu)建了“基礎(chǔ)規(guī)范實(shí)驗(yàn)”“綜合設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)”“研究探索（創(chuàng)新、開(kāi)放）型實(shí)驗(yàn)”相結(jié)合的新模式，[1-2]同時(shí)將實(shí)驗(yàn)教學(xué)與“大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃”、[3]大學(xué)生科技創(chuàng)新”等活動(dòng)有機(jī)結(jié)合，使學(xué)生完成“從依附性到相對(duì)獨(dú)立性的轉(zhuǎn)變、從被動(dòng)性到相對(duì)主動(dòng)性的轉(zhuǎn)變”，提高學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?，從而更加有利于拔尖?chuàng)新人才的培養(yǎng)。

本課題組多年來(lái)致力于土壤污染微生物修復(fù)研究，[4]積極將以一些科研成果轉(zhuǎn)化為綜合型、設(shè)計(jì)型、創(chuàng)新型的實(shí)驗(yàn)，這類實(shí)驗(yàn)既能有效培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)，提高了學(xué)生參與科學(xué)研究的興趣。同時(shí)，作為學(xué)生參與課題組科研工作前的培訓(xùn)，可以使學(xué)生熟悉課題組的基本工作，實(shí)現(xiàn)從學(xué)習(xí)性的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)到創(chuàng)新性的科研訓(xùn)練之間的無(wú)縫銜接和過(guò)渡。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)特定土壤樣品DNA提取方法的選擇和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，鍛煉了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能，培養(yǎng)了學(xué)生實(shí)驗(yàn)方案選擇和設(shè)計(jì)能力，完成學(xué)生實(shí)驗(yàn)由被動(dòng)到主動(dòng)的轉(zhuǎn)變。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，學(xué)生文獻(xiàn)檢索、實(shí)數(shù)據(jù)處理、結(jié)果分析、總結(jié)和歸納的能力也得到了訓(xùn)練，從而為學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室參與科研工作奠定了初步基礎(chǔ)。

1 教學(xué)設(shè)計(jì)

本專業(yè)學(xué)生可以根據(jù)自己的興趣申請(qǐng)，利用課余時(shí)間參與課題組科研項(xiàng)目的實(shí)施。實(shí)驗(yàn)從文獻(xiàn)查詢、方案設(shè)計(jì)到結(jié)果分析均由學(xué)生自行完成；教師只對(duì)學(xué)生錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行糾正，并提供必要的引導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)配制不同功能的試劑和洗脫劑，配制高效的土壤腐殖酸吸附劑，優(yōu)化納米TiO2和活性炭的比例，完成從土壤環(huán)境中獲取微生物懸液，去除冗余雜質(zhì)，獲得粗制DNA、精制DNA的過(guò)程，并對(duì)最終獲得的DNA進(jìn)行濃度及純度的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 土壤樣品

土壤樣品取自于天津市靜海區(qū)普通小麥田，農(nóng)田土壤類型均為褐土，采樣深度為表層土下10～20 cm，按5點(diǎn)取樣法， -20℃保存。

2.2 土壤總DNA的提取

方法1：采用Mo Bio公司的土壤DNA提取試劑盒Power Soil DNA Isolation Kit，參照說(shuō)明書提取。

方法2：凍融法提取土壤DNA，具體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)。[5]用70%乙醇洗沉淀，沉淀溶解于TE緩沖液，終體積50 L。

方法3：創(chuàng)新性配置腐殖酸吸附劑2 ml（0.2 mol/L納米TiO2；0.1% 活性炭）混合充分震蕩1 min；之后操作參考文獻(xiàn)[6]并加以改進(jìn)。最終用冷的70%乙醇洗滌沉淀2次，用TE緩沖液溶解沉淀，最終體積為50 L。

2.3 DNA濃度和純度的檢測(cè)

采用紫外分光光度法分別測(cè)定粗制DNA溶液的光密度值OD260，OD230， OD280，根據(jù)公式：[dsDNA]=50譕D260紫∈捅妒撲鉊NA的濃度（單位為 g/mL），換算出每克干土提取DNA的量，根據(jù)OD230/OD260，OD260/OD280估算DNA的純度。

2.4 PCR

采用細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后得到250 bp左右的片段。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 土壤總DNA的提取和檢測(cè)

本研究所提取的土壤DNA經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)，其濃度依次為每克土壤10.4～13.8 g、15.6～20.7 g、24.9～30.8 g，其中方法3土壤DNA提取得率最高（表1）。

DNA樣品的純度使用OD260/OD280和OD260/OD230兩個(gè)指標(biāo)檢測(cè)，從表1可以看出，降低蛋白質(zhì)污染的效果方法3（1.645～1.814）優(yōu)于方法1（1.545～1.731）和方法2（1.548～1.666）；降低腐殖質(zhì)污染的效果方法3（1.82～2.19）和方法1（1.71～2.50）相近，優(yōu)于方法2（1.66～1.71）。

表1 土壤總DNA的提取量和純度

3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

三種方法的瓊脂糖凝膠電泳效果見(jiàn)圖1。方法3所得的DNA濃度較高。對(duì)所得的DNA 進(jìn)行16S DNA 擴(kuò)增（圖2），方法3所得的DNA條帶清晰、明亮，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物濃度較高，DNA模板獲得有效擴(kuò)增。

綜合以上結(jié)果，方法3提取的DNA在濃度上有較大提高，DNA純度無(wú)明顯變化?？紤]到學(xué)生實(shí)驗(yàn)試劑使用劑量上的變化，優(yōu)先選用方法3，其DNA提取效率較高，經(jīng)濟(jì)合算。

4 結(jié)語(yǔ)

將課題組科研實(shí)踐中常用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)改造成適合本科生的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，開(kāi)設(shè)“土壤微生物高質(zhì)量DNA提取實(shí)驗(yàn)”這一綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，旨在使學(xué)生掌握基本的實(shí)驗(yàn)操作，培育學(xué)生科研工作自主性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的不斷摸索，學(xué)生不但掌握土壤DNA提取技術(shù)的原理和操作要點(diǎn)，極大的提高了解決具體問(wèn)題的能力，團(tuán)隊(duì)合作的意識(shí)也得到了進(jìn)一步加強(qiáng)。以創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)等形式作為學(xué)生參與科研實(shí)踐的序曲，不僅能使學(xué)生順利的融入課題組，更能夠在自主的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中訓(xùn)練學(xué)生的科研思維、培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲兴仞B(yǎng)，從而提高了本科人才培養(yǎng)的質(zhì)量，促進(jìn)了教學(xué)與科研的相互融合。

*通訊作者：李亮

基金項(xiàng)目：河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金（QN2018014）；國(guó)家自然科學(xué)基金 （31801948）；“河北工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目（201810080013）

參考文獻(xiàn)

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