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    TSP1對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響研究

    2019-07-11 07:50:22周才芳曾秀琴曾慶義
    關(guān)鍵詞:高糖腎小管培養(yǎng)液

    周才芳 曾秀琴 曾慶義

    糖尿病腎病是常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥,其是誘導(dǎo)終末期腎病發(fā)生的主要原因之一,腎小管上皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡、分泌等作用,腎小管上皮細(xì)胞損傷是終末期腎病發(fā)生的重要病理變化[1-2]。研究顯示,高糖可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和氧化損傷,這可能是糖尿病腎病腎組織損傷發(fā)生的機(jī)制之一[3]。血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondin1,TSP1)是一種與細(xì)胞凋亡、血管生成和細(xì)胞黏附等有關(guān)的多功能蛋白質(zhì),其在人體的腦組織、血管、肺臟和心臟等組織中廣泛表達(dá),在機(jī)體受到氧化應(yīng)激以后,其在成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中高表達(dá),TSP1參與腫瘤、衰老和免疫等相關(guān)疾病的發(fā)生[4-5]。目前的研究已經(jīng)顯示,TSP1在糖尿病腎病組織中高表達(dá),TSP1表達(dá)水平與腎組織腎小管上皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)[6-7]。本研究以腎小管上皮細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染TSP-1 shRNA(shTSP-1),沉默TSP-1基因;以轉(zhuǎn)染慢病毒為對(duì)照,探討下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響,為研究糖尿病腎病腎小管組織損傷提供參考。

    材料與方法

    一、材料

    腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心;SYBR Premix Ex Taq Realtime PCR試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit購(gòu)自大連Takara公司;TSP1抗體購(gòu)自美國(guó)BioVision公司;TSP1 shRNA慢病毒和對(duì)照慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司;引物由金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素 -8(interleukin-8,IL-8)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所;丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abnova公司;活化的Caspase-3(c-caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司;Polybrene購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

    二、方法

    1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組:(1)對(duì)照組:腎小管上皮細(xì)胞,以5.6 mmol/L的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)高糖組:腎小管上皮細(xì)胞,以含有30 mmol/L的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng);(3)NC+高糖組:轉(zhuǎn)染方法同干擾+高糖組,只是將轉(zhuǎn)染的TSP1 shRNA慢病毒換成對(duì)照慢病毒。(4)干擾+高糖組:腎小管上皮細(xì)胞接種到24孔板內(nèi),放在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度為50%時(shí),把TSP1 shRNA慢病毒用含有10%胎牛血清的DMEM稀釋,分別添加至24孔板內(nèi),感染復(fù)數(shù)調(diào)整為10,同時(shí)在孔內(nèi)添加 5 μg/ml的 Polybrene,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,將原培養(yǎng)液吸棄后,添加新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的DMEM),繼續(xù)培養(yǎng)3 d。用嘌呤霉素篩選10 d,取穩(wěn)定感染TSP1 shRNA慢病毒的腎小管上皮細(xì)胞,用30 mmol/L的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,用Realtime PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中 TSP1表達(dá)水平。(1)Realtime PCR:高糖組和對(duì)照組細(xì)胞分別用PBS洗滌細(xì)胞,按每 10 cm2細(xì)胞加 1 ml的 TRIZOL,用 200 μl氯仿將RNA抽提以后,分別添加500 μl的異丙醇溶液沉淀RNA,75%乙醇溶液洗滌,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD 260 nm/OD 280 nm的比值(介于1.8 ~ 2.0之間)。取適量的RNA,按照PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成的cDNA保存在-80℃。用SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行Realtime,PCR程序?yàn)椋?0℃,30 s;(95℃,5 s;60℃,30 s)×40個(gè)循環(huán)。按照2-△△CT方法計(jì)算分析TSP1的表達(dá)。GAPDH引物 Sense:5,-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3',Antisense:5,-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'。TSP1 引物 Sense:5,-GGCCACTGCAGCTGATGCGATGC GTAA-3',Antisense:5,-GGACACAACGACTGGC TTCTGGAC-3'。(2)Western Blot:高糖組和對(duì)照組細(xì)胞分別用PBS洗滌2次,加入蛋白裂解液,于冰上裂解 30 min以后,4 ℃高速,12 000×g離心10 min,各組蛋白存在于上清液中。按照BCA法分別對(duì)蛋白定量檢測(cè)以后,于-80℃保存。把蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合,100 ℃煮沸反應(yīng)5 min。依照每孔中的上樣量為30 μg進(jìn)行電泳,設(shè)置濃縮膠中電壓為80 V,設(shè)置分離膠中電壓為120 V,電泳總時(shí)長(zhǎng)為2.5 h。在4 ℃條件下,以100 V電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,把存在于凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在5 %牛血清白蛋白中37 ℃孵育結(jié)合2 h。PVDF膜置1 : 800稀釋的TSP1抗體反應(yīng)液中,于4 ℃過(guò)夜,再放置于1 : 3 000稀釋的二抗中,37 ℃反應(yīng)1.5 h。按照ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光以后,GAPDH作為內(nèi)參,對(duì)TSP1蛋白進(jìn)行定量分析。

    3.細(xì)胞中ROS水平檢測(cè):對(duì)照組、高糖組、NC+高糖組、干擾+高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,收集細(xì)胞,用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平,步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū),以激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm的熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度,用熒光強(qiáng)度表示ROS表達(dá)水平。

    4.細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量檢測(cè):對(duì)照組、高糖組、NC+高糖組、干擾+高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,用硫代巴比妥酸法檢測(cè)培養(yǎng)液中MDA含量,步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)。

    5.細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量檢測(cè):對(duì)照組、高糖組、NC+高糖組、干擾+高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-8含量,步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)。

    6.細(xì)胞凋亡檢測(cè):對(duì)照組、高糖組、NC+高糖組、干擾+高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,收集細(xì)胞,分別用300 μl的緩沖液將各組細(xì)胞懸浮以后,依次添加 Annexin V-FITC和PI工作液各 5 μl,置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)凋亡情況,在檢測(cè)前每組再添加200 μl的結(jié)合緩沖液。

    7.細(xì)胞中c-caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測(cè):對(duì)照組、高糖組、NC+高糖組、干擾+高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,收集細(xì)胞,用Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中c-caspase-3蛋白表達(dá)水平,步驟同上。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

    采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析,細(xì)胞中TSP1 mRNA和蛋白表達(dá)量、細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8、MDA含量等用表示,兩組均數(shù)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組均數(shù)間差異比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá):結(jié)果見(jiàn)圖1和表1中所示,高糖處理可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

    2.TSP1 siRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá):結(jié)果見(jiàn)圖2和表2中所示,在腎小管上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TSP1 shRNA后,可以明顯下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

    圖1 Western Blot測(cè)定高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)影響

    表1 高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)(±s)

    表1 高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)(±s)

    分組 重復(fù)次數(shù) TSP1 mRNA TSP1蛋白對(duì)照組 3 1.00 0.36±0.05高糖組 3 2.65±0.14 0.75±0.09 t 值 20.414 6.561 P值 < 0.01 < 0.01

    圖2 Western Blot檢測(cè)TSP1 shRNA對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表影響

    表2 TSP1 shRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)水平(±s)

    表2 TSP1 shRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)水平(±s)

    注:與高糖組比較,aP < 0.05;與 NC +高糖組比較,bP < 0.05

    分組 重復(fù)次數(shù) TSP1 mRNA TSP1蛋白高糖組 3 1.00 0.73±0.09 NC+高糖組 3 1.01±0.12 0.71±0.06干擾+高糖組 3 0.38±0.06ab 0.25±0.06ab F值 65.117 43.373 P值 < 0.01 < 0.01

    3.下調(diào)TSP1減少高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子分泌:結(jié)果見(jiàn)表3中所示,高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量升高;下調(diào)TSP1可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量。

    4.下調(diào)TSP1減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷:結(jié)果見(jiàn)表4,圖3中所示,高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞中ROS水平升高,同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量也升高;下調(diào)TSP1可以明顯抑制高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS表達(dá),減少細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量。

    5.下調(diào)TSP1減少高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡:結(jié)果見(jiàn)圖4和表5中所示,高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞中c-caspase-3蛋白水平升高;下調(diào)TSP1可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡率和c-caspase-3蛋白水平(圖5)。

    表3 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8 含量影響(±s)

    表3 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8 含量影響(±s)

    注:與對(duì)照組比,aP < 0.05;與高糖組比較,bP < 0.05;與 NC+高糖組比較,cP < 0.05

    分組 重復(fù)次數(shù) TNF-α(ng/ml)IL-8(ng/ml)對(duì)照組 3 20.14±1.36 12.98±1.63高糖組 3 45.91±2.87a 25.42±3.26a NC+高糖組 3 46.32±5.24 26.91±2.74干擾+高糖組 3 34.20±2.06bc 18.75±1.62bc F值 43.825 21.155 P值 < 0.01 < 0.01

    表4 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS和培養(yǎng)液中MDA含量影響(±s)

    表4 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS和培養(yǎng)液中MDA含量影響(±s)

    注:與對(duì)照組比,aP < 0.05;與高糖組比較,bP < 0.05;與 NC+高糖組比較,cP < 0.05

    分組 重復(fù)次數(shù) ROS MDA含量(nmol/ml)對(duì)照組 3 5.20±0.63 1.05±0.13高糖組 3 9.65±0.49a 2.36±0.21a NC+高糖組 3 9.71±0.62 2.30±0.42干擾+高糖組 3 6.96±0.50bc 1.63±0.10bc F值 45.652 18.595 P值 < 0.01 < 0.01

    表5 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡和c-caspase-3蛋白水平影響(±s)

    表5 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡和c-caspase-3蛋白水平影響(±s)

    注:與對(duì)照組比,aP < 0.05;與高糖組比較,bP < 0.05;與 NC+高糖組比較,cP < 0.05

    分組 重復(fù)次數(shù) 凋亡率(%)c-caspase-3對(duì)照組 3 4.69±0.51 0.26±0.03高糖組 3 24.56±2.38a 0.85±0.09a NC+高糖組 3 23.92±2.69 0.86±0.07干擾+高糖組 3 18.48±1.23bc 0.45±0.04bc F值 69.632 69.187 P值 < 0.01 < 0.01

    圖3 熒光顯微鏡下觀察下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS含量影響(×200)

    圖4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡變化

    圖5 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中c-caspase-3蛋白水平

    討 論

    糖尿病腎病是一種常見(jiàn)的引起終末腎疾病的原因之一,高糖環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞功能損傷是糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵[8]。高血糖可以誘導(dǎo)腎組織中氧化應(yīng)激和炎癥損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高,說(shuō)明成功構(gòu)建了糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞損傷模型。

    TSP1是一種糖蛋白,由3個(gè)相同的肽鏈構(gòu)成的外基質(zhì)糖蛋白,其分子量約為145 kDa,因最初是在血小板純化中發(fā)現(xiàn)而得名[12]。TSP1蛋白含有6個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,分別發(fā)揮血小板調(diào)控、血管生成、誘導(dǎo)凋亡、鈣離子結(jié)合和細(xì)胞黏附等作用[13]。正常情況下,TSP1在腦組織、肺臟等多種組織中表達(dá),內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等在受到炎癥、氧化應(yīng)激等刺激后能夠高表達(dá)TSP1。TSP1可促進(jìn)氧化損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[14]。很多研究顯示,TSP1是一種與纖維化疾病發(fā)生有關(guān)的調(diào)控因子,在糖尿病腎病、糖尿病心肌病等組織中高表達(dá)。TSP1還能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)上調(diào),與文獻(xiàn)報(bào)道一致,均提示,TSP1在糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。

    腎小管上皮細(xì)胞是腎臟組織的重要組成部分,在受到外界因素刺激后,能夠分泌大量的炎癥因子,促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)[16]。TNF-α在糖尿病腎病腎組織中表達(dá)上調(diào),其可以由腎小管上皮細(xì)胞分泌,是腎組織炎癥反應(yīng)的促進(jìn)因子[17]。IL-8也是一種促炎因子,高血糖刺激腎臟后可以誘導(dǎo)IL-8的分泌和表達(dá)[18]。TSP1是一種炎癥誘導(dǎo)因子,其表達(dá)缺失可以減輕組織和細(xì)胞炎癥[19]。本組資料干擾+高糖組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α和IL-8明顯低于NC+高糖組,提示下調(diào)TSP1具有抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8、減輕炎癥反應(yīng)的作用。

    研究表明,炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān),炎癥因子可以刺激細(xì)胞中ROS產(chǎn)生,同時(shí)細(xì)胞中ROS過(guò)度積累可以誘導(dǎo)炎癥因子分泌。細(xì)胞中過(guò)量的ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化,產(chǎn)生大量的MDA[20]。另外,ROS還可以激活細(xì)胞中Caspase凋亡蛋白的激活,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生,Caspase-3活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆反應(yīng)的標(biāo)志[21]。本組資料干擾+高糖組的細(xì)胞中ROS水平明顯低于NC+高糖組;培養(yǎng)液中MDA含量亦明顯降低,提示下調(diào)TSP1的表達(dá)可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS水平,減少細(xì)胞中MDA合成,同時(shí)下調(diào)TSP1還可以抑制高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中Caspase-3活化,減少細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激而減少細(xì)胞凋亡。

    本組資料表明,下調(diào)TSP1可能通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞分泌炎癥因子、減輕炎癥損傷并減少細(xì)胞凋亡,TSP1可能是治療糖尿病腎病的潛在靶點(diǎn),為以后研究TSP1在糖尿病腎病中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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