T細胞、BCL-2、BAX對重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細胞移植術(shù)后感染的臨床意義分析

張彥 萬佳

再生障礙性貧血為血液系統(tǒng)重癥疾病之一，其因獲得性骨髓造血功能衰竭，致機體全血細胞減少，主要以紅細胞、粒細胞和血小板減少所引起的貧血、感染和出血為特征。再生障礙性貧血臨床預(yù)后較差，多數(shù)患者死于感染或者出血等并發(fā)癥，尤其是重型再生障礙性貧血患者[1]。研究發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)治療再生障礙性貧血的效果不佳，強化免疫抑制治療，雖然再生障礙性貧血的緩解率顯著上升，但仍有30%左右患者治療無效，甚至死亡[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，異基因造血干細胞移植術(shù)治療重型再生障礙性貧血的效果較好，可有效恢復(fù)患者造血功能，降低患者病死率，但術(shù)后發(fā)生感染的風(fēng)險仍較高，嚴重影響移植的治療效果[3]。研究發(fā)現(xiàn)，再生障礙性貧血患者伴有不同程度免疫功能缺陷[4]。而重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細胞移植發(fā)生感染后，進一步影響機體免疫功能，有學(xué)者認為，免疫功能紊亂與細胞凋亡密切相關(guān)，包括BCL-2蛋白、BAX蛋白、caspase蛋白等被激活，表達上調(diào)有關(guān)[5]。因此，探究T細胞計數(shù)、BCL-2、BAX蛋白表達在重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細胞移植術(shù)后感染患者表達及意義，為臨床了解細胞免疫與細胞凋亡間的關(guān)系提供一定的理論依據(jù)。具體報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

本次研究經(jīng)過西南醫(yī)院倫理委員會審批。納入標準：（1）符合《再生障礙性貧血診斷治療專家共識（2010年版）》[6]中重型再生障礙性貧血診斷標準（需至少滿足以下其中2項指標：網(wǎng)織紅細胞＜ 1%，絕對計數(shù)＜ 15×109個/L；中性粒細胞絕對計數(shù)＜0.5×109個/L；血小板 ＜ 20×109個/L）；（2）無其他血液系統(tǒng)及免疫疾??；（3）入組者均簽訂知情同意書。排除標準：（1）入組前1周服用皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑；（2）拒絕入組研究者。根據(jù)納入排除標準，選擇西南醫(yī)院2014年1月至2018年1月收治的52例重型再生障礙性貧血異基因造血干細胞移植患者作為研究對象，依據(jù)干細胞移植是否發(fā)生感染（診斷標準：術(shù)后1個月內(nèi)發(fā)生的各種感染；有明確感染病灶；感染相關(guān)部位微生物培養(yǎng)陽性；患者至少有以下一種癥狀或體征；反復(fù)發(fā)熱（體溫 ＞38.5℃或持續(xù)時間超過24 h、寒戰(zhàn)）分為未發(fā)生感染組（32例）、感染組（20例）。兩組研究中一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05，表1）。

表1 再生障礙性貧血患者的一般資料

二、方法

1.干細胞移植方法：兩組患者入院后均完善相關(guān)檢查，明確干細胞移植適應(yīng)癥及禁忌癥；預(yù)處理：予以兔抗人胸腺細胞球蛋白+氟達拉濱（30 mg/ m2，連用5 d）+環(huán)磷酰胺[60 mg/（kg·d），連用2 d]；移植物抗宿主病預(yù)防：全相合移植患者予以環(huán)孢素A+短程甲氨蝶呤；造血干細胞動員、采集及回輸：供者予以粒細胞集落刺激因子（G-CSF）300 μg/d，皮下注射，連用4 d，第5天采集供者骨髓并回輸，次日使用COBE血細胞單采機分離供者外周血干細胞后回輸；并發(fā)癥預(yù)防：移植前2周靜滴更昔洛韋預(yù)防巨細胞病毒感染，清開靈、丹參及保肝藥物預(yù)防肝靜脈阻塞綜合征，口服復(fù)方新諾明預(yù)防“卡氏肺孢子病”，移植前1 d開始預(yù)防性抗感染治療，移植后白細胞最低期口服伏立康唑片，移植后7 ～ 10 d白細胞極低期聯(lián)合給予靜脈用丙種球蛋白，移植后定期監(jiān)測巨細胞病毒復(fù)制及病原菌培養(yǎng)，積極靜脈營養(yǎng)、抗感染和支持對癥治療。

2.T細胞計數(shù)檢測：收集入組者清晨空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝，6 h內(nèi)完成淋巴細胞表型分析；采用流式細胞儀（FACScalibur型，美國Becton Dickinson公司）對T淋巴細胞亞群進行檢測，流式抗體標記樣本、檢測步驟嚴格按照說明書進行，計數(shù)成熟T淋巴細胞亞群所占細胞數(shù)百分比，總淋巴細胞（CD3+）、T 輔助細胞亞群（CD4+）、T 抑制細胞亞群（CD8+），以及T輔助細胞/T抑制細胞比值（CD4+/ CD8+）。流式細胞檢測的配套試劑盒（Becton Dickinson公司）。

3.BCL-2、BAX蛋白表達檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測BCL-2、BAX蛋白表達情況；收集入組者清晨空腹靜脈血5 ml，9 000×g離心10 min后獲得血清，放入-20℃條件下保存；取血清樣本，在37 ℃條件下孵育2 h，加入BCL-2、BAX抗體，在37 ℃條件下孵育2 h，再加入底物液，在37 ℃條件下孵育30 min，測定OD值。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒由Ogema公司提供，操作嚴格按照說明書執(zhí)行。

4.隨訪：采用電話、門診對入組患者進行隨訪，隨訪時間為12個月，記錄兩組患者生存情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，性別、移植術(shù)后感染發(fā)生情況采用[n（%）]表示，用c2檢驗比較差異；年齡、身體質(zhì)量指數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、BCL-2、BAX、BCL-2/BAX 采用表示，采用卡方檢驗比較兩組患者生存率；采用Pearson 相關(guān)性檢驗分析CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX 值相關(guān)性。符合正態(tài)分布計量資料，比較采用t檢驗，非正態(tài)分布計量資料采用秩和檢驗，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.異基因造血干細胞移植后感染與移植類型之間的關(guān)系：人組織相容性抗原配型：全相合31例，其中12例（38.71%）發(fā)生感染；不全相合21例，其中8例（38.10%）發(fā)生感染，不同人組織相容性抗原配型干細胞移植術(shù)后感染發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（c2= 1.3064，P= 0.3427）。供者來源：同胞間移植39例，其中14例（35.90%）發(fā)生感染；供者為父母單倍型移植11例，其中5例（48.45%）發(fā)生感染；中國骨髓庫提供非血緣全相合移植2例，其中1例（50.00%）發(fā)生感染；不同供者來源干細胞移植術(shù)后感染發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)（c2=2.4625，P= 0.0722）。兩組患者干細胞移植術(shù)后均為發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)。

2.兩組患者外周血T細胞亞群檢測情況：未感染組患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于感染組，CD8+水平低于感染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表2）。

3.兩組患者BCL-2、BAX蛋白表達情況：未感染組患者外周血BCL-2蛋白表達水平及BCL-2/ BAX值高于感染組，BAX蛋白表達水平低于感染組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

4.CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值的相關(guān)性：采用Pearson相關(guān)性檢驗分析CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細胞移植后CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX 值呈現(xiàn)正相關(guān)（r= 0.620，P＜ 0.001，圖1）。

表2 兩組SAA患者外周血T細胞亞群檢測情況（±s，個/μl）

表2 兩組SAA患者外周血T細胞亞群檢測情況（±s，個/μl）

分組 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+未感染組 32 79.09±15.40 128.78±24.36 74.17±5.48 1.68±0.15感染組 20 57.62±10.36 86.17±11.22 76.79±4.36 1.15±0.10 t 值 5.107 3.626 3.260 8.311 P值 0.009 0.024 0.031 ＜0.001

表3 兩組SAA患者BCL-2、BAX蛋白表達情況（±s）

表3 兩組SAA患者BCL-2、BAX蛋白表達情況（±s）

分組 例數(shù) BCL-2 BAX BCL-2/BAX未感染組 32 0.48±0.10 0.33±0.04 1.07±0.06感染組 20 0.34±0.07 0.41±0.12 0.83±0.04 t 值 5.394 4.605 6.032 P值 0.008 0.013 0.005

5.隨訪結(jié)果：對入組患者隨訪6 ～ 12個月（本次研究因前期納入患者臨床資料收集不全，所納入病例數(shù)僅有23例隨訪時間超過1年，因而界定隨訪時間為1年）；非感染組患者1年生存率為90.63%（29/32），感染組患者1年生存率為50.00%（10/20），兩組患者生存率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（c2=6.2184，P= 0.0064）。生存曲線圖見圖2。

圖1 重型再生障礙性貧血CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值的相關(guān)性

圖2 兩組患者1年隨訪生存情況

討 論

重型再生障礙性貧血是一種由T淋巴細胞介導(dǎo)的、損傷骨髓的疾病。既往研究認為，再生障礙性貧血是由不明原因，如氯霉素、放射線和病毒感染等，引起的造血功能衰竭[7]。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，再生障礙性貧血的發(fā)病機制與造血干細胞功能喪失密切相關(guān)，導(dǎo)致患者骨髓的總體集落形成能力下降；由多種致病因素導(dǎo)致造血微環(huán)境功能缺陷，損傷造血干（祖）細胞及基質(zhì)細胞受損；再生障礙性貧血患者多伴有免疫功能異常，機體免疫異常，可損傷造血干細胞，并占著主導(dǎo)作用；遺傳因素，部分再生障礙性貧血患者對于某些致病因素的敏感性較高，進而增加再生障礙性貧血發(fā)生風(fēng)險。

目前臨床中再生障礙性貧血的治療主要包括支持治療、病因治療，支持治療主要以預(yù)防和治療血細胞減少所引起的并發(fā)癥為目的；病因治療主要以補充和替代數(shù)量減少和受損的造血干細胞為目的，避免損害進一步加重，盡可能恢復(fù)受損的造血干細胞功能，如異基因造血干細胞移植、免疫抑制治療等[11-12]。異基因造血干細胞移植是在大劑量放化療處理基礎(chǔ)上，清除患者體內(nèi)腫瘤或異常細胞后，將異基因造血干細胞移植給患者，重建患者正常造血及免疫系統(tǒng)。目前異基因造血干細胞移植是治療重型再生障礙性貧血的主要策略之一，不僅可延長患者生存期，且治療反應(yīng)穩(wěn)定，克隆性疾病發(fā)生風(fēng)險低，患者生活質(zhì)量顯著提高[13-14]。但是重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細胞移植后伴有繼發(fā)感染風(fēng)險，不僅影響治療效果，同時影響患者機體免疫功能，嚴重者可死亡[15]。本次研究結(jié)果顯示，入組52 例重型再生障礙性患者，異基因造血干細胞移植術(shù)后感染發(fā)生率為38.46%，術(shù)后感染發(fā)生率較高，并且影響患者生存期。另外，在干細胞移植過程中應(yīng)用抗生素，不僅可降低感染發(fā)生風(fēng)險，同時利于移植后患者免疫功能恢復(fù)。干細胞移植后并發(fā)感染具有一定特殊性及復(fù)雜性，其臨床表現(xiàn)不典型，病原菌培養(yǎng)陽性率低，感染病灶不明確，但并發(fā)感染患者病情進展速度快、病死率高，因此，降低患者異基因造血干細胞移植術(shù)后感染發(fā)生率，具有重要意義。

T淋巴細胞包括T輔助細胞亞群（CD4+）、T抑制細胞亞群（CD8+），正常情況下，機體T淋巴細胞總數(shù)CD3+/CD4+值較為穩(wěn)定，當T淋巴細胞亞群數(shù)量及比值出現(xiàn)變化時，提示機體免疫功能出現(xiàn)紊亂。通過檢測外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞，可反映機體免疫功能，進而對機體感染進行輔助診斷[16]。黎偉超等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+、CD4+/ CD8+值降低，與惡性腫瘤的發(fā)生、病毒感染密切相關(guān)，CD8+參與機體細菌及病毒的清除，其水平升高，提示機體存在細菌或真菌感染。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未感染組患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+水平高于感染組，CD8+水平低于感染組，結(jié)果說明異基因造血干細胞移植術(shù)后發(fā)生感染，進一步損傷免疫功能，進而影響患者術(shù)后造血功能的重建。

研究發(fā)現(xiàn)[18]，BCL-2蛋白可抑制細胞程序性死亡，參與細胞線粒體、核孔復(fù)合體信號的傳遞；并且能夠改變線粒體外模通透性，調(diào)節(jié)細胞凋亡因子的釋放；另外，BCL-2還可影響鈉鉀泵功能，減少因輻射所引起的細胞凋亡。BAX蛋白為一種促凋亡蛋白，為BCL-2蛋白家族中成員之一，其可過度表達拮抗BCL-2的保護作用，促進細胞凋亡[19]。Vervloessem等[20]研究發(fā)現(xiàn)，細胞的凋亡與BCL-2/ BAX值密切相關(guān)，BCL-2/BAX值升高，提示細胞凋亡受到抑制。本次研究發(fā)現(xiàn)，未感染組患者外周血BCL-2蛋白表達水平及BCL-2/BAX值高于感染組，BAX蛋白表達水平低于感染組，Pearson相關(guān)性檢驗分析發(fā)現(xiàn)重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細胞移植后CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值呈現(xiàn)正相關(guān)；結(jié)果說明，異基因造血干細胞移植術(shù)后感染可能參與調(diào)節(jié)細胞凋亡，促進相關(guān)凋亡蛋白表達，加速免疫細胞凋亡。

綜上所述，重型再生障礙性貧血異基因造血干細胞移植術(shù)后發(fā)生感染，導(dǎo)致患者免疫功能異常，可能與細胞凋亡蛋白BCL-2表達上調(diào)有關(guān)，且術(shù)后發(fā)生感染顯著縮短患者生存期，因此，可通過評估SAA患者T細胞水平，BCL-2、BAX蛋白表達情況，評估患者預(yù)后。但本次研究主要回顧性分析臨床資料，關(guān)于免疫功能與BCL-2、BAX蛋白間的關(guān)系尚不明確，需后續(xù)進一步研究證實。