體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

潘倩 章建全 張傳森

甲狀腺功能減退癥發(fā)病率不斷攀升，干細(xì)胞治療甲狀腺功能減退癥的研究備受關(guān)注，選擇適宜的種子細(xì)胞，并將其誘導(dǎo)成甲狀腺濾泡細(xì)胞（thyroid follicular cells，TFCs）是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Lin等[1]首次將小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells，ES）誘導(dǎo)成TFCs。此后，利用促甲狀腺激素、活化素A、胰島素或胰島素樣生長因子-1等誘導(dǎo)ES[2-4]，但效果并不顯著。研究熱點(diǎn)繼而轉(zhuǎn)向ES及誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）中核轉(zhuǎn)錄因子8（paired box gene 8，PAX8）與甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1）基因過表達(dá)[5-8]。然而，ES及iPS面臨的倫理爭議勢必限制其臨床應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSCs）為成體干細(xì)胞，可向內(nèi)胚層分化，具有廣闊臨床應(yīng)用前景。目前利用間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成甲狀腺前體細(xì)胞已經(jīng)有了初步可行性研究[9-11]，但均未對分化程度鑒定及分化條件優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)旨在通過甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子TTF1、PAX8及甲狀腺濾泡細(xì)胞標(biāo)志性蛋白分子鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium/iodide cotransporter，NIS）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）、甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）探索BMSCs向TFCs分化的適宜條件。

材料與方法

一、材料

1、細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動物：大鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞系（FRTL-5細(xì)胞系），購自 American Type Culture Collection（美國模式培養(yǎng)物保藏所，ATCC）。150 g雄性SD大鼠，購于上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

2.細(xì)胞培養(yǎng)試劑及耗材：DF-12培養(yǎng)基（DMEM/F-12 Medium，液體，含15mmol/L HEPES，L-谷氨酰胺，500 ml）（美國Gibco公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Invitroegn公司）；牛促甲狀腺素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、胰島素（insulin，來源于牛胰腺）、氫化可的松（hydrocortisone，HC）、生長抑素（somatostatin，SST）、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）（美國SIGMA公司）；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、EP管、離心管等（美國Costar Corning 公司）。

3.免疫熒光試劑：兔單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體（英國Abcam公司）；兔多克隆抗體（英國Biorbyt公司）；山羊抗兔IgG（RED）、山羊抗小鼠IgG（RED）（美國Invitrogen公司）。

4.RT-PCR主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材：總RNA提取試劑（美國Invitroegn公司）；第一鏈cDNA合成試劑盒（美國Thermo公司）；熒光定量試劑盒（瑞士Roche公司）；引物（美國Invitroegn公司）；離心管、TIP頭（美國Axygen公司）。

二、方法

（一）BMSCs向甲狀腺細(xì)胞分化的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

1.BMSCs的分離、培養(yǎng)：取150 g左右雄性SD大鼠，按全骨髓貼壁法分離、純化獲取原代BMSCs，擴(kuò)增至第3代，備用。

2.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為5組：陰性對照組（B組）：P3代SD大鼠BMSCs懸液以1×105個/ ml的細(xì)胞密度接種于6孔板，每孔加入3 ml含10%FBS的D/F-12培養(yǎng)基。陽性對照組（T組）：FRTL-5細(xì)胞懸液以1×105個/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板，每孔加入3 ml 含5%FBS的FRTL-5培養(yǎng)基。共培養(yǎng)組（C組）：將P3代SD大鼠BMSCs懸液以1×105個/ml 的細(xì)胞密度接種于6孔板，嵌入Transwells小室。調(diào)節(jié)FRTL-5細(xì)胞密度為1×105個/ml，將 FRTL-5加入Transwells小 室 PET膜上。用含10%FBS的DF-12培養(yǎng)基將Transwells小室內(nèi)外液體均補(bǔ)足為1.5 ml。誘導(dǎo)素組（F組）：P3代SD大鼠BMSCs懸液以1×105個/ ml 的細(xì)胞密度接種于6孔板，每孔加入3 ml 含10%FBS的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。隔天全量換液，誘導(dǎo)7 d。共培養(yǎng)+誘導(dǎo)素組（C+F組）：將P3代SD大鼠BMSCs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基重懸，懸液以1×105個/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板，嵌入Transwells小室。調(diào)節(jié)FRTL-5細(xì)胞密度為1×105個/ ml，將 FRTL-5加入Transwells小室PET膜上。用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將Transwells小室內(nèi)外液體均補(bǔ)足為1.5 ml。

（二）誘導(dǎo)分化細(xì)胞的分析及鑒定

1.形態(tài)學(xué)觀察：以FRTL-5作為形態(tài)學(xué)陽性對照組，倒置相差顯微鏡下逐日觀察C+F組、C組和F組中誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.細(xì)胞 TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO 表達(dá)蛋白的免疫熒光染色：細(xì)胞免疫熒光染色法檢測經(jīng)不同條件誘導(dǎo)后的細(xì)胞中蛋白標(biāo)志物TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO的表達(dá)。主要步驟包括：BMSCs經(jīng)共培養(yǎng)+誘導(dǎo)素、共培養(yǎng)及誘導(dǎo)素三種不同條件下誘導(dǎo)1周后，消化離心收集細(xì)胞，重懸，接種于鋪有玻片的24孔板，培養(yǎng)1 d。巴氏吸管吸除24孔板中培養(yǎng)液，PBS充分洗滌后，以4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，PBS洗3遍，取出玻片置于封口膜上，有細(xì)胞的一面向上。滴加0.3%TritonX-100，室溫下15 min透膜；用10%山羊血清室溫封閉30 min。PBS充分洗滌，按照說明書，加入按1 : 100或1 : 50比例稀釋的一抗，4℃濕盒內(nèi)過夜。16 h后PBS洗去一抗，加入1 : 100稀釋的羅丹明標(biāo)記的熒光二抗，避光保存4 h，PBS充分洗滌，以0.5%DAPI處理15 min標(biāo)記細(xì)胞核，PBS充分洗滌后甘油封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光顯示情況。

3.RT-PCR基因轉(zhuǎn)錄分析法檢測不同培養(yǎng)條件下基因 TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO 的表達(dá)：具體步驟：（1）mRNA的提??；（2）總RNA濃度的測定；（3）RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；（4）RT-PCR檢測基因表達(dá)情況（反應(yīng)引物序列見表1）。按照Sybr Green試劑盒進(jìn)行操作。

表1 特異性引物核苷酸序列

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同培養(yǎng)條件下基因 TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO RT-PCR 數(shù)據(jù)由表示，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析（ANOVA），兩組間資料差異比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

1周后倒置顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長情況，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)較B組略有改變，細(xì)胞表面凸起略少。另外C+F組部分底層細(xì)胞趨向于培養(yǎng)孔邊緣生長，且形態(tài)變化顯著（圖1）。

二、甲狀腺濾泡細(xì)胞特異表達(dá)抗原及相關(guān)基因表達(dá)的免疫熒光分析

1.TTF1：C+F組顯示為胞核、胞漿均有表達(dá)，以胞核表達(dá)更為明顯。C組顯示為胞核、胞漿均有表達(dá)，但較C+F組弱，以胞核為著。F組顯示為僅有胞核表達(dá)（圖2）。

2.PAX8：C+F組顯示為核周及胞漿內(nèi)均有表達(dá)，以核周為著。C組顯示為陰性。F組顯示為胞漿內(nèi)有表達(dá)。（圖3）

3.NIS：C+F組顯示為胞漿內(nèi)表達(dá)，C組顯示為胞漿內(nèi)表達(dá)，F(xiàn)組顯示為胞漿內(nèi)表達(dá)，背景有異染（圖4）。

4.TPO：C+F組顯示為胞漿表達(dá)。C組顯示為胞核及胞漿表達(dá)。F組顯示為胞核及胞漿表達(dá)。（圖5）。

5.Tg：C+F組Tg顯示為胞漿表達(dá)。C組Tg顯示為陰性。F組Tg顯示為胞核表達(dá)（圖6）。

三、RT-PCR基因轉(zhuǎn)錄分析法測定基因TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO 的表達(dá)

將BMSCs經(jīng)共培+誘導(dǎo)素、共培及誘導(dǎo)素三種不同條件下誘導(dǎo)1周后，實(shí)時熒光定量PCR檢測各組中轉(zhuǎn)錄因子TTF1、PAX8及標(biāo)志性蛋白NIS、Tg和TPO mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，與C+F組比較，B組、C組、F組PAX8（F= 283.07，P＜ 0.05）、TTF1（F= 73.36，P＜ 0.05）、TG（F= 134.03，P＜0.05）mRNA水平下降（表2）。

討 論

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)1周時細(xì)胞形態(tài)

圖2 熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞TTF1表達(dá)情況（免疫細(xì)胞熒光染色法）

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子是一類僅在甲狀腺濾泡細(xì)胞中共同表達(dá)的蛋白質(zhì)，與甲狀腺器官胚胎發(fā)育及分化成熟密切相關(guān)，甲狀腺祖細(xì)胞的存活及增長依賴于 TTF1、TTF2、PAX8和HEX的共同調(diào)節(jié)，因而TTF1、TTF2、PAX8和HEX的聯(lián)合表達(dá)被視為甲狀腺細(xì)胞所特有[12]。其中轉(zhuǎn)錄因子TTF1和PAX8在甲狀腺發(fā)生中至關(guān)重要[13]。2012年Antonica等[5]研究表明PAX8和TTF1在小鼠胚胎干細(xì)胞中的瞬時表達(dá)能夠驅(qū)動其向甲狀腺上皮細(xì)胞譜系的分化，TTF1的超表達(dá)能夠誘導(dǎo)TTF2的表達(dá)，即TTFs之間存在相互作用的等級層次網(wǎng)絡(luò)，且PAX8及TTF1位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游[7,14-15]。相較于基因過表達(dá)的技術(shù)手段，本實(shí)驗(yàn)通過不同誘導(dǎo)條件對BMSCs進(jìn)行刺激，培養(yǎng)1周后經(jīng)細(xì)胞免疫組化檢測到TTF1及PAX8的不同表達(dá)情況，以共培體系中添加誘導(dǎo)物質(zhì)的條件下TTF1和PAX8的表達(dá)最為顯著。

圖3 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞PAX8表達(dá)情況

圖4 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞標(biāo)志性蛋白NIS表達(dá)情況

甲狀腺激素的生物合成有賴于甲狀腺濾泡細(xì)胞特有的標(biāo)志性蛋白分子TSHR、NIS、Tg、TPO等蛋白質(zhì)的正常表達(dá)[16-17]。Tg、TPO、TSHR和NIS基因的聯(lián)合表達(dá)為甲狀腺濾泡細(xì)胞特有[18-20]。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子對TSHR、NIS、Tg、TPO的基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)在甲狀腺生發(fā)及功能的形成及維持中是必不可少的。TTF1調(diào)節(jié)Tg、TPO、TSHR及NIS的基因轉(zhuǎn)錄；TTF2調(diào)控Tg和TPO的基因啟動子；PAX8調(diào)節(jié)Tg、TPO和NIS的基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，用細(xì)胞免疫熒光法在PAX8和TTF1表達(dá)顯著的共培+誘導(dǎo)素組中檢測到NIS、TPO和Tg的顯著表達(dá)；而僅有TTF1表達(dá)的共培組未檢測到Tg的表達(dá)；TTF1弱表達(dá)和PAX8表達(dá)的誘導(dǎo)因素組Tg弱表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子PAX8和TTF1不同的表達(dá)情況，可能是致使各實(shí)驗(yàn)組Tg、TPO及NIS表達(dá)不同的關(guān)鍵因素。

圖5 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞標(biāo)志性蛋白TPO表達(dá)情況

圖6 免疫細(xì)胞熒光法檢測培養(yǎng)1周后各組細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Tg表達(dá)情況

RT-PCR測定與對照組比較，TPO mRNA水平在共培組中有增高趨勢；NIS mRNA水平在3組中均有增高趨勢；PAX8 mRNA水平在共培+誘導(dǎo)素組、誘導(dǎo)素組中有不同程度增高趨勢；TTF1 mRNA水平在共培+誘導(dǎo)素組、共培組中有不同程度增高趨勢；Tg mRNA水平在共培+誘導(dǎo)素組中有明顯增高趨勢。整體而言，認(rèn)為共培+誘導(dǎo)素組各甲狀腺相關(guān)標(biāo)識蛋白基因的變化趨勢最為理想。

表2 RT-PCR檢測TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO在各組細(xì)胞中的表達(dá)（n = 3，±s）

表2 RT-PCR檢測TTF1、PAX8、NIS、Tg、TPO在各組細(xì)胞中的表達(dá)（n = 3，±s）

注：與 B 組比較，aP ＜ 0.05；與 C+F 組比較，bP ＜ 0.05；與 C組比較，cP ＜ 0.05

分組 TPO NIS PAX8 TTF1 TG B 組 0.07±0.03 0.05±0.01 0.02±0.01 0.03±0.01 0.10±0.05 C+F 組 0.23±0.07 0.55±0.07a 6.21±0.04a 0.33±0.04a 15.00±2.00a C 組 0.40±0.15a 0.60±0.09a 0.54±0.31b 0.15±0.03ab 1.61±0.40b F 組 0.04±0.02c 0.70±0.07ab 3.31±0.30abc 0.08±0.02b 1.91±0.39b F值 12.33 59.12 283.07 73.36 134.03 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01