27nt-miRNA對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響*

趙燕姣， 顏淵鴛， 李 丹， 羅雪蘭， 楊 鵬，周福隆， 楊瑞霞， 唐雙意， 歐和生△

（1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院科技部，廣西南寧530201；3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西南寧530021）

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）是一層位于血管壁內(nèi)側(cè)的扁平單層細(xì)胞。正常生理情況下，VECs 通過調(diào)節(jié)血流與血管壁之間的物質(zhì)交換維持著血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；在血管損傷，機(jī)械損傷，及氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）、活性氧、促炎細(xì)胞因子和高水平的一氧化氮（nitric oxide，NO）等生物活性因子的刺激作用下，VECs 的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞入侵和血管壁脂質(zhì)沉積，從而導(dǎo)致血管壁增厚與管腔狹窄。Ox-LDL 是一種動脈粥樣硬化的促進(jìn)因子，它可與內(nèi)皮細(xì)胞表面的LOX-1 受體結(jié)合以誘發(fā)氧化連接反應(yīng)導(dǎo)致膽固醇沉積，從而引起細(xì)胞凋亡［1］。VECs凋亡在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）等血管生成性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類含有19～22 個核苷酸（nucleotide，nt）的高度保守的非編碼單鏈小分子 RNA［3］。新近研究顯示，miRNA 逐漸成為血管生成性疾病相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡的重要調(diào)控因子，如miR126-3p 高表達(dá)可以抑制HLMVEC 的增殖、促進(jìn)其凋亡，使血管生成所阻［4］；miR-106b 可通過調(diào)節(jié)PTEN 的表達(dá)激活PI3K/AKT 通路，促進(jìn)HAEC 增殖，抑制其凋亡［5］。我們的前期研究證實，來自內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）第4 內(nèi)含子中的27 堿基重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄的RNA（27nt-miRNA，27nt-miR）高表達(dá)可顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖、遷移和血管生成，這與27nt-miR 抑制eNOS 的表達(dá)/活性及其代謝產(chǎn)物NO的合成與釋放相關(guān)［6］。由于NO 不僅是維持血管舒張功能的重要因子，而且參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡的調(diào)節(jié)［7］，故推測 27nt-miR 可通過對相關(guān)凋亡基因的調(diào)控，參與VECs增殖、遷移與凋亡的調(diào)節(jié)。為證實上述推測，本研究通過建立體外Ox-LDL 誘導(dǎo)HUVECs 凋亡模型 ，探 討 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘 導(dǎo)HUVECs 凋亡的影響以及作用機(jī)制，為AS 等慢性心血管疾病的治療提供參考資料。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

HUVECs（Procell）；DMEM培養(yǎng)液（Gibco）；胎牛血清（Lonsera）；慢病毒載體（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；氧化低密度脂蛋白（廣州奕元生物技術(shù)公司）；CCK-8（武漢博士德生物技術(shù)公司）；Hoechst 33258 染色試劑盒和caspase-3 活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin V-APC/7-AAD 凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；TRIzol 試劑盒（Axygen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR RT-qPCR 試劑盒（TaKaRa）；兔抗 Bcl-2 抗體、兔抗 Bax 抗體、兔抗 caspase-3 抗體、兔抗 GAPDH 抗體及抗兔lgG（H+L）熒光II 抗（Cell Signaling Technology）。實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）；倒置相差熒光顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 27 nt-miR 慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定 委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司以27nt-miR 序列（5′-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3′）設(shè)計27nt-miR高表達(dá)慢病毒載體，然后以其反義序列及陰性對照隨機(jī)序列構(gòu)建anti-27nt-miR 和miR-NC 慢病毒載體。以 Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-Puromycin 為載體，經(jīng)AgeI/NheI 雙酶切，轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，濃縮得到目的慢病毒載體。病毒載體上含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白，可觀察綠色熒光表達(dá)并用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。

2.2 HUVECs 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和實驗分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以細(xì)胞密度為5×107/L，按每孔2 mL將細(xì)胞懸液接種于6 孔板，孵育過夜至細(xì)胞貼壁。上述3 種慢病毒載體以感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=70 感染HUVECs，置于培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染10 h 后更換新鮮完全培養(yǎng)液。參考 Zhang 等［5］的方法，實驗分為5 組：（1）正常對照組；（2）Ox-LDL 組；（3） 27nt-miR+Ox-LDL 組 ；（4） anti-27nt-miR+Ox-LDL 組；（5）miR-NC+Ox-LDL 組。除正常對照組正常培養(yǎng)外，Ox-LDL 組給予40 mg/L Ox-LDL 處理48 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其余轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均先轉(zhuǎn)染相應(yīng)慢病毒質(zhì)粒繼而給予40 mg/L Ox-LDL 處理48 h 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.3 CCK-8 法檢測 HUVECs 活力 參考蔡爽等［8］的方法，將各組細(xì)胞接種到96孔板中，每孔5×103個，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后按設(shè)定實驗條件處理，每孔加入110 μL CCK-8 試劑（100 μL 培養(yǎng)液+10 μL CCK-8），避光孵育 1 h 后，酶標(biāo)儀檢測 450 nm 波長處各組的吸光度（A450），實驗重復(fù)3 次。細(xì)胞活力（%）=（實驗組A450值-調(diào)零組A450值）/（空白組A450值-調(diào)零組A450值）×100%。

2.4 劃痕法檢測HUVECs 的遷移能力 參考沈鳳等［9］的方法，將各組細(xì)胞接種于 48 孔板中，每孔 3×104個，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，培養(yǎng)細(xì)胞至密度100%融合，用吸頭垂直各孔底部中間劃“一”字痕，PBS 沖洗3次，然后加入含40 mg/L Ox-LDL的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于顯微鏡下觀察0 h 和24 h 的遷移愈合情況，實驗重復(fù)3 次。遷移率（%）=（0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

2.5 caspase-3 活性試劑盒檢測caspase-3 活性 參考Chen等［10］的方法，取各組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105個，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，加入含40 mg/L Ox-LDL 的無血清培養(yǎng)液2 mL 繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集并冰浴裂解各組細(xì)胞，取上清液 50 μL，加入 40 μL 檢測液和 10 μL Ac-DEVD-pNA，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測405 nm 波長處各組的吸光度（A405），實驗重復(fù)3次。

2.6 Hoechst 33258 染色法檢測HUVECs 的凋亡情況 參考李松巖等［11］的方法，取無菌蓋玻片置于6孔板內(nèi)，將各組細(xì)胞以每孔5×104個接種于玻片上，待細(xì)胞生長至密度為70%時，每組分別加入40 mg/L的Ox-LDL 刺激48 h，棄去培養(yǎng)液，加入0.5 mL 固定液 10 min。PBS 洗滌 3 次，加入染色液 5 min，PBS 洗滌3 次。將熒光淬滅封片液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下隨機(jī)拍取5 個不同的視野，計算細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3 次。細(xì)胞凋亡率（%）=視野內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HUVECs 的凋亡率 參考蔡爽等［8］的方法，取各組細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔 2×105個，待細(xì)胞貼壁后給予 40 mg/L 的 Ox-LDL 處理48 h。收集細(xì)胞并清洗。取500 μL上樣緩沖液重懸細(xì)胞。每管依次加入5 μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD，輕柔混勻后，室溫避光孵育15 min，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

2.8 RT-qPCR 法檢測 HUVECs 中 Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表達(dá)情況 用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA。委托上海生工生物工程設(shè)計、合成目標(biāo)引物，序列見表1。分別取各組細(xì)胞總RNA 1 μg，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，按SYBR RT-qPCR 試劑盒說明書加入反應(yīng)體系，上機(jī)檢測。每個樣本重復(fù)測定3 次，取平均值，以 GAPDH 為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，40 個循環(huán)；最后 72℃延伸 5 min，終止反應(yīng)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 Western blot 法 檢測 HUVECs 中 Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)情況 收集并裂解各組細(xì)胞，取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度。分別取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，分別加入相應(yīng)Ⅰ抗稀釋液（稀釋比例1∶1 000），4℃孵育過夜。次日加入熒光Ⅱ抗（稀釋比例1∶10 000）室溫避光孵育1 h。利用LICOR 公司的Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析蛋白電泳條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參照。蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。單因素方差分析用于多組間比較，LSD-t檢驗用于組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘導(dǎo)的 HUVECs 活力的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC+Ox-LDL 組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），而anti-27ntmiR+Ox-LDL組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.27nt-miR inhibited the viability of HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖1 27nt-miR抑制HUVECs活力

2 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘導(dǎo)的 HUVECs 遷移能力的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組HUVECs 遷移率降低（P＜0.05）；與 miR-NC+Ox-LDL 組相比，27ntmiR+Ox-LDL 組HUVECs 遷移率顯著降低（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組HUVECs 遷移率顯著升高（P＜0.05），見圖2。

3 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘 導(dǎo) 的 HUVECs 中 cas?pase-3活性的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組HUVECs 內(nèi)caspase-3 相對活性升高（P＜0.05）；與miR-NC+Ox-LDL組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組 HUVECs 內(nèi) caspase-3的相對活性顯著升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組 HUVECs 內(nèi) caspase-3 的相對活性顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 27nt-miR對Ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響

Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率顯著高于正常對照組（P＜0.05）；與 miR-NC+Ox-LDL 組相比，27ntmiR+Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率降低（P＜0.05），見圖4。

5 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘導(dǎo)的 HUVECs 凋亡率的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與miR-NC+Ox-LDL 組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率顯著升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL組HUVECs的凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖5。

6 27nt-miR 對 Bax、caspase-3和Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組Bax 和caspase-3 mRNA 的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而 Bcl-2 mRNA 的相對表達(dá)量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表達(dá)比例顯著降低（P＜0.05）；與 miR-NC+Ox-LDL 組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3 mRNA 的 相 對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表達(dá)比例顯著降低（P＜0.05），而 anti-27nt-miR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3的 mRNA 相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 的相對表達(dá)量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表達(dá)比例顯著升高（P＜0.05），見圖6。

7 27nt-miR 對 Bax、caspase-3和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

Ox-LDL組Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平高于正常對照組（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)比例低于正常對照組（P＜0.05）；27ntmiR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3 蛋白表達(dá)水平較miR-NC+Ox-LDL 組上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平和 Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)比例下調(diào)（P＜0.05）；而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3 蛋 白 表 達(dá)水平較 miR-NC+Ox-LDL 組下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)比例上調(diào)（P＜0.05），見圖7。

Figure 2.27nt-miR inhibited the migration of HUVECs.The scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖2 27nt-miR抑制HUVECs的遷移

Figure 3.27nt-miR increased the activity of caspase-3 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group圖3 27nt-miR增強(qiáng)HUVECs內(nèi)caspase-3活性

討 論

本實驗通過研究27nt-miR 對Ox-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs 凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制，得到結(jié)果如下：（1）27nt-miR 可促進(jìn)Ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；（2）27nt-miR 促進(jìn)Ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的同時，抑制細(xì)胞的活力和遷移；（3）27nt-miR 通過促進(jìn)Ox-LDL誘導(dǎo)的Bax和caspase-3表達(dá)上調(diào)及Bcl-2表達(dá)下調(diào)參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可破壞內(nèi)皮完整性和屏障功能，引起炎性細(xì)胞浸潤，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和新內(nèi)膜形成，促進(jìn)脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致AS等血管疾病的發(fā)生發(fā)展［12］。Ox-LDL是引發(fā)和促進(jìn)AS 等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的危險因素之一，它可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。研究表明，正常生理條件下，低濃度的Ox-LDL 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在維持血管壁環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，而高濃度的Ox-LDL 則可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或壞死［1］。研究表明，Ox-LDL 可通過調(diào)控PI3K/Akt 信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，引起組織缺血和血管形成受損，加重冠狀動脈進(jìn)程［13］。本實驗中，觀察到使用 Ox-LDL 刺激HUVECs 后細(xì)胞的凋亡率顯著上升，細(xì)胞活力和遷移率顯著下降，提示Ox-LDL 對HUVECs 具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。

內(nèi)皮細(xì)胞的異常凋亡、增殖和遷移是AS 等心血管疾病發(fā)展中的重要致病事件［14］。miRNA 作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展［15］。例如，miR-200c-3p 通過結(jié)合鋅指結(jié)合E-box 的同源盒2，抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腎動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，減輕高血壓性腎損傷［16］。miR-345-3p 在 Ox-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs 凋亡過程中表達(dá)下調(diào)，其通過靶向TRAF6抑制Ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減緩 AS 的發(fā)展［17］。miR-497 在 AS 模型鼠和 Ox-LDL 誘導(dǎo)HUVECs凋亡過程中均表達(dá)上調(diào)，其通過調(diào)控Bcl-2/Bax-caspase-9-caspase-3 途徑抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重AS 炎癥程度［18］。本課題組前期研究表明，27nt-miR 參與調(diào)節(jié)VECs 的增殖、遷移和管腔形成，并抑制哺乳動物雷帕酶素靶蛋白誘導(dǎo)的VSMCs 凋亡［19］。在本實驗中，我們通過將 27nt-miR高表達(dá)與anti-27nt-miR 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs，之后用Ox-LDL刺激HUVECs，結(jié)果顯示，27nt-miR 高表達(dá)可顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，與此同時內(nèi)皮細(xì)胞的增殖速度與遷移能力顯著降低，而抑制27ntmiR 表達(dá)則可以部分緩解Ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和增殖、遷移抑制。這一結(jié)果提示27nt-miR 可促進(jìn)Ox-LDL 誘導(dǎo)的 HUVECs 凋亡，并且抑制 HUVECs 增殖和遷移。

Figure 4.27nt-miR promoted the apoptosis of HUVECs induced by Ox-LDL.The apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining.The scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖4 27nt-miR促進(jìn)Ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，可以通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，激活下聯(lián)caspase級聯(lián)反應(yīng)，或作為抗氧化劑防止多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［20］。Bax是Bcl-2 同源的水溶性相關(guān)蛋白，凋亡發(fā)生時，Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體，Bax 蛋白被激活，誘導(dǎo)線粒體膜電位降低，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活半胱氨酸蛋白酶caspase-9，繼而活化下游效應(yīng)蛋白caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。caspase-3作為半胱氨酸蛋白酶家族一員，是細(xì)胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)中的下游關(guān)鍵蛋白，被認(rèn)為是凋亡中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，caspase-3 活性是凋亡過程主要的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，27nt-miR 高表達(dá)可負(fù)調(diào)控Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)Bax 和caspase-3 的蛋白表達(dá)，增強(qiáng)caspase-3 活性，而抑制27nt-miR 表達(dá)則表現(xiàn)出相反的趨勢。因此，我們推測27nt-miR 可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3、Bax和Bcl-2 的表達(dá)，影響 Ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。此外，值得注意的是，多數(shù)miRNAs在基因轉(zhuǎn)錄水平通過抑制翻譯或促進(jìn)RNA 降解調(diào)控靶基因表達(dá)，例如miR-338-3p 通過靶向抑制AMBI的mRNA 3'非翻譯區(qū)抑制其表達(dá)，促進(jìn)Ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［22］。因此，本研究進(jìn)一步通過 qRT-PCR 檢測各組 Bax、caspase-3和Bcl-2的mRNA 改變情況，結(jié)果顯示，27nt-miR 高表達(dá)顯著促 進(jìn) Bax和caspase-3 的 mRNA 表 達(dá) ，而 Bcl-2 的mRNA 表達(dá)和Bcl-2/Bax 比例均顯著降低。這提示27nt-miR 在基因轉(zhuǎn)錄水平參與了 Bax、caspase-3 和Bcl-2 mRNA 的調(diào)控，進(jìn)而影響了 Bax、caspase-3 和Bcl-2 的蛋白表達(dá)，最終參與Ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

Figure 5.27nt-miR promoted the apoptosis of HUVECs induced by Ox-LDL.The apoptosis was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖5 27nt-miR促進(jìn)Ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

綜上所述，本研究初步明確27nt-miR 可促進(jìn)Ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，并抑制HUVECs的活力和遷移，這與27nt-miR 調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-3和Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

Figure 6.27nt-miR up-regulated the mRNA expression levels of Bax and caspase-3 and down-regulated the mRNA expression level of Bcl-2 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖6 27nt-miR上調(diào)HUVECs中Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)水平

Figure 7.27nt-miR up-regulated the protein expression levels of Bax and caspase-3 and down-regulated the protein expression level of Bcl-2 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖7 27nt-miR上調(diào)HUVECs中Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平