食品中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)同時檢測方法的建立

孔凡華,張一凡,郭 倩,李菁菁,趙 禎,木其爾,田榮榮,崔亞娟,*

(1.北京市營養(yǎng)源研究所,北京市系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術研究中心,北京 100069;2.北京城市學院生物醫(yī)藥學部,北京 100083)

類胡蘿素是一類廣泛存在于植物、真菌、藻類和細菌中的黃色、橙紅色或紅色色素,目前在自然界已經(jīng)鑒定出來700多種[1]。其中葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)等為當前廣受關注的典型類胡蘿素,主要存在于天然果蔬中[2],在人體健康中扮演了重要的角色,具有很多生理功能[3]。如葉黃素、玉米黃質(zhì)具有較強抗氧化性[4],能夠清除自由基的影響,提高免疫功能,減少患慢性病[5]、癌癥[6]等的風險,可以預防和治療糖尿病[7],有效減少藍光對視網(wǎng)膜的傷害,預防年齡相關性黃斑變性等病癥[8]。葉黃素已經(jīng)廣泛應用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品、飼料等領域[9]。

葉黃素的分析檢測方法主要有:紫外-可見分光光度法[10-11]、高效液相色譜法(HPLC)[12-13]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[14-15]、紅外光譜法[16-17]、超臨界流體色譜法[18-19]、核磁共振法[20-21]等,在我國現(xiàn)行的國家標準中,葉黃素的分析方法為液相色譜法[22]。高效液相色譜法具有分離效果好、選擇靈敏性強、分離速度快、可與多種技術聯(lián)用等優(yōu)點,是目前使用最廣泛的對葉黃素進行定量分析的檢測方法,也是定量分析玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的常用方法。

葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的提取方法有:室溫皂化提取[23]、溫水浴提取[24]、超聲提取[24-25]、、冷丙酮提取[26]等,在提取過程中,葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)很容易發(fā)生氧化和結構異化,有必要建立快速溫和的提取方法,對其進行更精確的定量。葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)共同存在于食品基質(zhì)中,但同時將其分離和定量的相關研究較少。因此,建立食品中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)同時檢測技術具有重要的現(xiàn)實意義。本文在借鑒前人研究的基礎上,利用高效液相色譜法建立了食品中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的同時在線分析檢測方法,以小米和大米為樣品進行方法學驗證,采用建立的方法對不同食品基質(zhì)菊花、玉米、菠菜、橙子、雞蛋樣品進行葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的含量測定,旨在為科研和實際應用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小米、菊花、玉米、菠菜、橙子、雞蛋等樣品 市購;葉黃素標準品(純度≥97.0%)、玉米黃素標準品(純度≥95.0%)、β-隱黃質(zhì)標準品(純度≥97.0%)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 美國Sigma公司;甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯(均為色譜純) 美國Fisher公司;無水硫酸鈉、乙醇、正己烷、環(huán)己烷、異丙醇、氫氧化鉀、石油醚、抗壞血酸(均為分析純) 北京化工廠;無水乙醚 國藥集團化學試劑有限公司。

BS224S分析天平 德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;ZHWY-110X30往復式恒溫水浴搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司;EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化株式會社;Thermo U-3000高效液相色譜儀 美國Thermo Fisher科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取溶劑的選擇 準確稱取5份2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 50%氫氧化鉀水溶液,混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi),避光振蕩皂化30 min,取出立即冷卻至室溫。將5份皂化液分別用50 mL水轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中,每份樣品加入一種提取溶劑,這5種溶劑分別是:50 mL正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)混合液、50 mL正己烷∶乙酸乙酯(7∶3)混合液、50 mL環(huán)己烷∶乙酸乙酯(2∶8)混合液、50 mL正己烷∶異丙醇(3∶1)混合液、50 mL環(huán)己烷∶乙酸乙酯(1∶1)混合液,振蕩萃取5 min,將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250 mL分液漏斗中,分別加入50 mL上述萃取溶劑重復萃取,每次用約100 mL水洗滌萃取溶劑層,重復洗滌3次,直至將萃取溶劑層洗至中性,去除下層水相。合并兩次洗滌后的萃取溶劑層,經(jīng)無水硫酸鈉濾入150 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi),用約15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次,并入蒸發(fā)瓶內(nèi),將蒸發(fā)瓶接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上,40 ℃水浴減壓蒸餾,待瓶中萃取液剩下約2 mL時,取下蒸發(fā)瓶,立即用氮氣吹至近干。用2 mL含0.1% BHT的乙醇溶液定容。溶液過0.45 μm有機系濾膜后,按下述高效液相色譜條件測定。

1.2.2 前處理條件的選擇

1.2.2.1 堿溶液的選擇 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液,分別加入10 mL 10%氫氧化鉀水溶液、10 mL 20%氫氧化鉀水溶液、10 mL 50%氧化鉀水溶液、10 mL 60%氫氧化鉀水溶液、10 mL 10%氫氧化鉀甲醇溶液、10 mL 30%氫氧化鉀甲醇溶液混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi),避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻至室溫。分別用100 mL正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)混合液提取,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.2.2 皂化溫度的選擇 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液,加入10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,于25、50、75 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻到室溫。分別用100 mL正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)混合液提取,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.2.3 皂化時間的選擇 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液,加入10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi),避光振蕩皂化5、10、15、30、45和60 min,取出立即冷卻至室溫。分別用100 mL正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)其他操作步驟同1.2.1。

1.2.3 不同前處理方法比較研究

1.2.3.1 國標方法 準確稱取2.0 g均勻小米于50 mL離心管中,以10 mL正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)混合液萃取溶劑,避光渦旋振蕩提取3 min,4500 r/min離心3 min,重復提取2次,合并提取液,于室溫減壓濃縮至近干,以3 mL萃取溶劑渦旋振蕩溶解,重復操作1次,合并萃取溶劑,混勻,以約1 mL/min的流速過已活化的中性氧化鋁固相萃取小柱,用3 mL萃取溶劑洗脫,合并流出液與洗脫液,于室溫減壓濃縮至近干,以0.1% BHT乙醇溶液,渦旋振蕩溶解殘渣并定容至10 mL,過0.45 μm濾膜,供液相色譜測定。

1.2.3.2 超聲提取方法 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,混勻。常溫避光超聲提取30 min,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.3.3 實驗建立方法 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻到室溫,其他操作步驟同1.2.1。

1.2.4 方法學驗證實驗

1.2.4.1 標準曲線的繪制 準確稱取葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)標準品1 mg(精確到0.1 mg),用丙酮定容至25 mL棕色容量瓶中,臨用前在波長445 nm處用丙酮作空白于分光光度計上標定溶液濃度。

準確吸取葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)標準儲備溶液,配制成不同濃度梯度的葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)標準溶液,以濃度為縱坐標,峰面積為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.4.2 方法精密度實驗 準確稱取2.0 g均勻小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60% 氫氧化鉀水溶液,混勻。于50 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)避光振蕩皂化15 min,取出立即冷卻至室溫,其他操作步驟同1.2.1,連續(xù)測定6次(n=6),驗證方法的精密度。

1.2.4.3 方法準確度實驗 取大米樣品,測定樣品中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)含量,結果均小于檢出限,以大米為空白樣品,進行三個標準添加水平的回收率試驗,每個添加水平重復測定3次,分別計算加標回收率和相對標準偏差。

1.2.5 色譜條件 色譜柱:YMC C30(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為二氯甲烷∶乙腈∶甲醇(2∶3∶5);檢測波長:445 nm;柱溫:30 ℃;進樣體積:20 μL。

1.2.6 含量的測定 葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)含量按下式測定:

式中:X為樣品中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的提取量,μg/100 g;c為由標準曲線而得的試樣溶液中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的濃度,μg/mL;V為試樣溶液最終定容體積,mL;m為試樣質(zhì)量,g。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

由于溶劑的極性差異、皂化液與各種提取劑的互溶性及分散狀況不同,不同萃取液對葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的溶解能力不同。強極性溶劑與弱極性溶劑混合后溶液的極性更容易與葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的極性接近,進而溶解更多的葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì),所以,混合溶劑比單溶劑對葉黃素的提取效果更好[27]。由表1知,小米中未檢測到β-隱黃質(zhì);正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)混合液對小米中葉黃素和玉米黃質(zhì)的萃取效果最佳,故選擇正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)混合液作為實驗提取溶劑。

表1 不同提取溶劑測定結果

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 堿溶液的優(yōu)化 由表2可知,隨堿濃度的增加,葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量呈現(xiàn)遞增趨勢;當堿溶液濃度小于 60%時,葉黃素酯分散性不好,影響皂化反應進行,使葉黃素含量低;當堿溶液濃度為60%時,葉黃素的含量達到最大值,故選擇60%氫氧化鉀水溶液作為實驗皂化溶液。

表2 不同堿溶液皂化測定結果

2.2.2 皂化溫度的優(yōu)化 由圖1可知,25 ℃皂化后葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量小于50 ℃,這是因為溫度升高,可以加快葉黃素酯轉(zhuǎn)化成游離葉黃素的效率。隨著溫度的升高,葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量減少,這是由于皂化溫度過高會導致葉黃素和玉米黃質(zhì)的分解。因此,皂化溫度控制在50 ℃為宜。

圖1 不同皂化溫度測定結果

2.2.3 皂化時間的優(yōu)化 由圖2可知,5～5 min之內(nèi)隨著皂化時間的延長,體系中葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量逐漸升高,在15 min時葉黃素含量達到最高,在15 min后葉黃素含量下降。說明15 min后,皂化反應生成葉黃素和玉米黃質(zhì)的速度小于葉黃素和玉米黃質(zhì)的降解速度。所以,皂化時間選擇15 min最佳。

圖2 不同皂化時間測定結果

2.3 不同前處理方法比較研究

由圖3可知,實驗建立的方法葉黃素提取率比超聲方法提高3.81%,比國標方法提高24.74%;玉米黃質(zhì)提取率比超聲方法提高0.78%,比國標方法提高11.08%。可見,實驗建立的方法可以實現(xiàn)葉黃素、玉米黃質(zhì)的快速溫和提取,對天然食品基質(zhì)中葉黃素和玉米黃質(zhì)的提取效果優(yōu)于超聲提取方法和國標方法。

圖3 不同前處理方法測定結果

2.4 方法學驗證實驗

2.4.1 標準曲線的繪制 由圖4可知,葉黃素在0.2342～9.3689 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好,線性回歸方程為Y=3.8333x,相關系數(shù)R2=0.9999;玉米黃質(zhì)在0.3004～12.0167 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好,線性回歸方程為Y=4.7156x,相關系數(shù)R2=0.9999;β-隱黃質(zhì)在0.3734～14.9371 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好,線性回歸方程為Y=3.7526x,相關系數(shù)R2=0.9996。葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)高效液相色譜圖見圖5。

圖4 標準曲線繪制

圖5 葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)標準譜圖

2.4.2 方法精密度實驗 由表3可知,平行測定6次,RSD均小于10%,表明方法的精密度良好,適合定量分析。

表3 方法精密度結果

2.4.3 方法準確度實驗 由表4可知,葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)加標回收率在85.6%～98.8%之間，平均加標回收率分別為90.3%、91.7%、90.5%,加標回收率的相對標準偏差分別為4.51%、7.60%、5.84%。能夠滿足檢測實際樣品的檢測需要。

表4 加標回收率實驗結果

2.5 食品中葉黃素含量的測定

選擇菊花、玉米、菠菜、橙子、雞蛋等葉黃素含量較高的天然食品基質(zhì),用本實驗建立的方法測定食品中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的含量,結果見表5。

表5 不同食品中葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的含量

由表5可知,菊花中葉黃素含量最高,菠菜中次之,菠菜和玉米中玉米黃質(zhì)含量較高,橙子和玉米中β-隱黃質(zhì)含量較高。

3 結論

本實驗優(yōu)化了葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的前處理條件,最終確定最優(yōu)前處理條件為:試樣中加入30 mL含0.1%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)乙醇溶液和10 mL 60%氫氧化鉀水溶液,置于恒溫水浴箱內(nèi)50 ℃振蕩皂化15 min,處理樣液用100 mL正己烷∶乙醚∶環(huán)己烷(2∶2∶1)混合液萃取。平行測定6次,葉黃素、玉米黃質(zhì)的相對標準偏差(RSD)分別為1.41%、4.98%,加標回收率在85.6%～98.8%之間,表明該方法重現(xiàn)性良好、準確可行。本實驗采用等度洗脫,12 min之內(nèi),葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)出峰完全并得到較好的峰型,與國標方法和文獻報道的梯度洗脫方法相比,色譜條件簡單,易于操作,同時,縮短了分析時間,節(jié)約成本。

實驗建立的方法葉黃素提取率比超聲方法提高3.81%,比國標方法提高24.74%;玉米黃質(zhì)提取率比超聲方法提高0.78%,比國標方法提高11.08%?？梢?實驗建立的方法對葉黃素、玉米黃質(zhì)的提取效率更高,可以更加準確定量食品中葉黃素、玉米黃質(zhì)的含量,彌補相關標準的不足和檢測方法的缺陷,為企業(yè)、科研機構的科學研究和質(zhì)量控制提供方法保障,給相關科研檢測機構和監(jiān)管部門提供技術支持,具有廣闊的應用前景和顯著的社會經(jīng)濟效益。