超高效液相色譜法(UPLC)測定豬肉中9種生物胺含量

鄧 浩,尹青春,譚高好,徐 彬,譚淑君,朱琰婷,王運(yùn)選

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所,海南?？?570100; 2.海南省熱帶果蔬冷鏈研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?570100; 3.海南省食品檢驗(yàn)檢測中心,海南海口 570100; 4.襄陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，湖北襄陽 441100)

生物胺是一類含氨基的具有生物活性的低分子量堿性有機(jī)化合物的總稱,主要包括色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺等[1]。食品中大部分的生物胺是在加工和貯藏過程中,食品表面的微生物釋放出氨基酸脫羧酶并催化氨基酸脫羧形成[2]。生物胺廣泛存在于各類食品中,尤其富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品,含有生物胺較多的食品有:魚、肉及其制品、干酪及乳制品、酒及各類發(fā)酵產(chǎn)品、水果、蔬菜等。因此,生物胺的含量多少可作為判別食品細(xì)菌性腐敗程度的指標(biāo)之一[3-5]。極少量生物胺是生物體內(nèi)的正?；钚猿煞?在生物細(xì)胞代謝中發(fā)揮著重要的生理作用。但當(dāng)人體內(nèi)蓄積到一定程度的生物胺,會(huì)引起諸如頭痛、惡心、心悸、呼吸紊亂等過敏反應(yīng),嚴(yán)重者還會(huì)危及生命。歐盟及我國對食品中生物胺做了限量:歐盟規(guī)定鯖魚科樣品中組胺≤100 mg/kg,其他食品中的組胺≤100 mg/kg,酪胺不得超過100～800 mg/kg[6];我國規(guī)定高組胺魚類樣品中組胺≤40 mg/100 g;其他魚類樣品中組胺≤20 mg/100 g[7-8]。

目前,生物胺的檢測方法有液相色譜法[4-5]、超高效液相色譜法[6]、氣相色譜法、薄層色譜法、傳感器法和毛細(xì)管電泳法[9]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等生物胺檢測方法。采用液相色譜法測定時(shí),重復(fù)性好、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確,是國內(nèi)外定量檢測食品中生物胺最常用的方法,也常用于檢測禽畜肉中生物胺的含量。但液相法往往需要柱前衍生,且普通液相法分離幾種物質(zhì)所需時(shí)間較長,不適用于批量檢測;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等分離時(shí)間短,不需要柱前衍生,但儀器設(shè)備昂貴,所需耗材成本高;離子色譜分離時(shí)間長,部分生物胺成分不能檢測[4];氣相法具有分離效率高、分析速度快、選擇性好等優(yōu)點(diǎn),但樣品前處理復(fù)雜耗時(shí),且對生物胺組分進(jìn)行定性分析時(shí),一般需要與質(zhì)譜聯(lián)用才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果,增加了設(shè)備的成本等。綜合以上方法的優(yōu)缺點(diǎn),本研究建立了超高效液相色譜法(Ultra performance liquid chromatography,UPLC)測定豬肉中9種生物胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹磺酰氯GR 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;甲醇、乙腈 色譜級,德國Merck公司;乙酸銨 色譜級,Fisher Chemical;三氯乙酸(簡稱TCA) AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、NaHCO3、丙酮 AR,廣州化學(xué)試劑廠;氨水 AR,西隴化工股份有限公司;9種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo) 詳見表1;市售豬肉 鄭華菜場2份,東門菜場2份,金鹿花園菜市場2份,城東菜市場2份,于2018年5月20～25日購買,放于-20 ℃冰箱儲(chǔ)藏。

表1 9種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)信息 Table 1 Standard and internal standard information of 9 biogenic amines

Waters 2695液相色譜(DAD和FLD(熒光檢測器))、Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高壓高效液相色譜儀(DAD(二極管陣列,下同)檢測器) 美國Waters公司;LC-20A液相色譜(DAD檢測器) 日本島津公司;Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;Mettler XS204十萬分之一分析天平 美國Mettler Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 準(zhǔn)確稱取各生物胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg(精確到 0.1 mg),甲醇溶解并定容至10.0 mL,配得濃度為1.0 mg/mL的單標(biāo)溶液;準(zhǔn)確吸取上述各單標(biāo)溶液適當(dāng)體積于100.0 mL容量瓶中,甲醇定容配得濃度為100.0 μg/mL的9種物質(zhì)混標(biāo)溶液;于4 ℃下避光保存。

1.2.2 儀器及色譜柱的選擇 UPLC法:本實(shí)驗(yàn)采用Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器),ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,流動(dòng)相:10 mmol/L乙酸銨(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序:0～7.0 min,40% A;7.1～11 min,15% A;11.1～13 min,40% A;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量3.0 μL;檢測波長為245 nm;柱溫35 ℃。以保留時(shí)間定性,峰面積百分比定量,內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。

本實(shí)驗(yàn)著重比較了Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器)、LC-20A島津(DAD檢測器)高效液相色譜儀、Waters e2695(DAD和FLD檢測器)高效液相色譜儀以及ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱、Agilent ZORBAX-AB C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱、Waters XBrige C18(5 μm,4.6×250 mm)色譜柱對生物胺分離效果。

Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器)采用ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,儀器條件按1.2.2敘述的UPLC法,進(jìn)樣的9種生物胺的濃度均為50.0 μg/mL;

以下均采用文獻(xiàn)報(bào)道的洗脫方法[12-14],洗脫程序均按表2,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量10 μL,DAD檢測器檢測波長245 nm,熒光檢測器檢測波長為激發(fā)波長入ex:350 nm、吸收波長入em:520 nm,進(jìn)樣的9種生物胺的濃度均為50.0 μg/mL。LC-20A島津液相(DAD檢測器)采用Agilent ZORBAX-AB C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱;Waters e2695液相(DAD檢測器)采用Waters XBrige C18(5 μm,4.6×250 mm)色譜柱;Waters e2695液相(FLD檢測器)采用Waters XBrige C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.2.3 樣品提取及衍生化

1.2.3.1 樣品提取條件及衍生化條件 提取:準(zhǔn)確稱取經(jīng)磨碎的試樣2.00 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加入2 mL 100 μg/mL內(nèi)標(biāo)使用液,加入10 mL 5% TCA,漩渦振蕩5 min,于4 ℃冷凍離心機(jī)離心10 min,轉(zhuǎn)速10000 r/min,離心后取上清液。殘?jiān)偌尤? mL 5% TCA重復(fù)提取一次,合并上清液,最后用5% TCA定容至20 mL,作為待測液。

衍生化:吸取生物胺樣品待測液及標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL置于10 mL離心管中,加入0.1 mL 100 μg/mL內(nèi)標(biāo)使用液,0.2 mL 2 mol/L NaOH溶液,0.3 mL飽和NaHCO3緩沖溶液,調(diào)節(jié)pH約為11,然后加入2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯(溶于丙酮),于60 ℃反應(yīng)15 min,立即加入0.2 mL氨水(25%)混勻,終止衍生反應(yīng),于暗處靜置20 min,用乙腈定容至10 mL,于4 ℃條件下10000 r/min離心3 min,取上清液過0.22 μm濾膜上機(jī)。

1.2.3.2 提取條件優(yōu)化 按照1.2.3.1樣品提取步驟,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及國標(biāo)的檢測方法進(jìn)行優(yōu)化,考察2%、5%、10% TCA提取液的提取效果[12-14]。

1.2.3.3 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的衍生化條件優(yōu)化 按照1.2.3.1衍生化步驟,采用2 mol/L氫氧化鈉和飽和NaHCO3緩沖溶液調(diào)節(jié)提取液的酸堿體系的pH為pH5、7和11左右[14],確定衍生化的最優(yōu)pH,比較不同溫度30、45、60 ℃進(jìn)行水浴的衍生效果[15-17]。

1.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

按照1.2.2 UPLC法的儀器條件,根據(jù)文獻(xiàn)[12-15]報(bào)道,以1.2.2 UPLC法的梯度洗脫程序和表3中A～D的洗脫程序進(jìn)行調(diào)試,以確定最佳流動(dòng)相,進(jìn)樣的9種生物胺的濃度均為50.0 μg/mL。

表3 梯度洗脫程序 表3 Gradient elution program

1.4 線性范圍、檢出限和定量限

精密吸取5.0～100.0 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液,按照1.2.2 UPLC法儀器條件進(jìn)行測定,以9種生物胺質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),各生物胺與內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)是通過空白豬肉樣品加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的方法測定的,其中當(dāng)信噪比S/N ≥3.0時(shí)的含量為檢出限,S/N ≥10.0時(shí)的含量為定量限。

1.5 回收率實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以豬肉為基質(zhì)做回收率實(shí)驗(yàn),取空白的豬肉樣品,9種生物胺的添加水平均為50、100、200 mg/kg,每個(gè)添加水平做6個(gè)平行,前處理方法及衍生化方法按1.2.3,儀器條件按1.2.2,進(jìn)行檢測,計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

對質(zhì)量濃度為50.0 μg/mL的9種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)測定6次,計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.7 樣品測定

通過建立的UPLC法對市場購買的8份豬肉樣品中生物胺的種類和含量進(jìn)行測定,每個(gè)樣品平行測定2次。

1.8 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的結(jié)果計(jì)算,Waters儀器自帶的Empower和島津儀器自帶的LC solution數(shù)據(jù)處理及繪圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器及色譜柱的篩選

由圖1～圖2可知,LC-20A島津和Waters e2695采用DAD檢測器,9種生物胺均達(dá)到較好的分離,且峰型較好,靈敏度較高,說明LC-20A島津(DAD檢測器)和Waters e2695(DAD檢測器)以及所使用的色譜柱Agilent ZORBAX-ABC18和Waters XBrige C18色譜柱均可用于生物胺的檢測。由圖3可知:采用Waters e2695(FLD檢測器)檢測,9種生物胺各組分有較好的分離度,但是FLD檢測的組胺、章魚胺和酪胺的響應(yīng)值較小;由圖4可知:采用Waters UPLC(DAD檢測器)檢測,9種生物胺組分在10 min內(nèi)被全部洗脫出來,分離度良好,峰型較好,雜峰較少,靈敏度較高。

圖1 LC-20A島津高效液相DAD檢測器檢測的9種生物胺標(biāo)品色譜圖Fig.1 Standard of 9 biogenic amines HPLC chromatogram of LC-20A DAD detector

圖2 Waters e2695高效液相DAD檢測器檢測的9種生物胺標(biāo)品色譜圖Fig.2 Standard of 9 biogenic amines HPLC chromatogram of Waters DAD detector

圖3 Waters e2695高效液相FLD檢測器檢測的9種生物胺標(biāo)品色譜圖Fig.3 Standard of 9 biogenic amines HPLC chromatogram of Waters FLD detector

圖4 Waters UPLC超高效液相DAD檢測器檢測的9種生物胺標(biāo)品色譜圖Fig.4 Standard of 9 biogenic amines UPLC chromatogram of Waters UPLC DAD detector注:1:色胺;2:β-苯乙胺;3:腐胺;4:尸胺;5:組胺; 6:章魚胺;7:1,7-二氨基庚烷(內(nèi)標(biāo));8:酪胺; 9:亞精胺;10:精胺;圖1～圖3，圖6～圖8同。

由圖1～圖3可知:LC-20A島津(DAD檢測器)和Waters e2695(DAD和FLR檢測器)及所使用的色譜柱均可對9種生物胺進(jìn)行檢測,但每一針樣品均耗時(shí)30 min以上,在實(shí)際檢驗(yàn)中,對于大批量豬肉類樣品中生物胺的檢測耗時(shí)過長,降低了檢測效率。因此,本文選擇采用Waters ACQUITY H UPLC? CLASS超高效液相色譜儀(DAD檢測器)進(jìn)行生物胺檢測方法的優(yōu)化。

2.2 提取條件及衍生化條件的優(yōu)化

優(yōu)化的提取及衍生條件為:豬肉樣品經(jīng)5% TCA(三氯乙酸)兩次提取,取提取液1 mL中加入0.2 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液,0.3 mL飽和NaHCO3緩沖溶液,調(diào)節(jié)pH11左右,然后加入丹磺酰氯溶液2 mL,于60 ℃水浴衍生反應(yīng)15 min,取出流水冷卻后,立即加入0.2 mL氨水(25%)混勻,終止衍生反應(yīng),于暗處靜置20 min,用乙腈定容至10 mL,于4 ℃條件下10000 r/min離心3 min,取上清液過濾膜上機(jī)?？瞻讟悠贰悠?、樣品加標(biāo)的圖譜如圖5～圖7所示。在該條件下,9種生物胺分離度較好,每一針樣品的上樣時(shí)間比普通液相縮短近3倍,各組分靈敏度好,大大縮減了在實(shí)際應(yīng)用中的時(shí)間成本,為快速測定豬肉類樣品中9種生物胺奠定了基礎(chǔ)。

圖5 空白樣品中生物胺的色譜圖Fig.5 UPLC chromatogram of biogenic amines in blank sample

圖6 豬肉樣品中生物胺的色譜圖Fig.6 UPLC chromatogram of biogenic amines in pork

圖7 豬肉樣品中加入生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(10mg/kg)Fig.7 UPLC chromatogram of pork sample spiked biogenic amine at 10 mg/kg

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

以表3洗脫程序A～D(表3洗脫程序A～D的出峰譜圖分別對應(yīng)圖8A～D)及1.2.2 UPLC法梯度洗脫程序進(jìn)行流動(dòng)相的優(yōu)化。由圖8可知,圖8A中β-苯乙胺出峰時(shí)間滯后,色胺和β-苯乙胺間有比較長一段平緩無雜質(zhì)峰出現(xiàn)的時(shí)間,因此,將β-苯乙胺等洗脫時(shí)間提前,即在表3-A的洗脫程序基礎(chǔ)上,將2～4.6 min內(nèi)有機(jī)相比例增大,調(diào)至表3-B洗脫程序,β-苯乙胺等的出峰時(shí)間提前,洗脫結(jié)果見圖8B;由圖8B可知:β-苯乙胺和腐胺間有比較長一段平緩無雜質(zhì)峰出現(xiàn)的時(shí)間,所以調(diào)節(jié)表3-B的洗脫程序至表3-C洗脫程序;從圖8C可知:腐胺等的保留時(shí)間只縮短0.5 min,且峰型及分離度仍然不是很好,因此,調(diào)至表3-D的洗脫程序;由圖8D可知:生物胺各組分達(dá)到很好的分離度,且峰型對稱;從圖8A～D可知,精胺均未出峰,調(diào)洗脫程序至1.2.2 UPLC法梯度洗脫程序,將7.1～11 min時(shí)間段內(nèi)的乙腈比例調(diào)大后,精胺出現(xiàn),說明高比例有機(jī)相可將精胺洗脫下來。因此,相比表3的洗脫程度結(jié)果(結(jié)果見圖8A～D)，采用1.2.2 UPLC法梯度洗脫程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(結(jié)果見圖4)。

圖8 流動(dòng)相優(yōu)化的譜圖Fig.8 Chromatogram of the flow phase optimization

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

UPLC法測定9種生物胺的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限以及定量限見表4。9種生物胺與內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積比值與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度呈良好的線性關(guān)系,線性范圍為5.0～100.0 μg/mL,相關(guān)性系數(shù)r≥0.999。色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺檢出限分別為0.240、0.018、0.095、0.130、0.170、0.290、0.033、0.028、0.080 mg/kg,比國標(biāo)GB 5009.208-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》中規(guī)定的檢出限20 mg/kg低很多,說明本檢測方法靈敏度較高。

表4 9種生物胺的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限及定量限Table 4 Retention time,linear equation,correlation coefficient,limits of detection and quantification of 9 biogenic amines

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

由表5可知,9種生物胺在豬肉中添加的回收率在70.70%～111.80%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.33%～9.40%之間,說明本方法回收率和重復(fù)性較好。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 5 Experimental results of recovery rate(n=6)

2.6 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

由表6可知:RSD(n=6)≤3.72%,這說明儀器具有較好的精密度,適用于生物胺的檢測。

表6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 6 Experimental results of precision(n=6)

2.7 樣品測定

由表7可知,不同豬肉樣品中含有的生物胺種類、含量及比例基本一致,豬肉中均含有精胺和β-苯乙胺,部分含有亞精胺和酪胺;有文獻(xiàn)報(bào)道:精胺和亞精胺是豬肉中的組成性胺類[18],β-苯乙胺也可能是在飼養(yǎng)豬時(shí)飼料中添加物質(zhì)[19];酪胺與反映產(chǎn)品腐敗品質(zhì)的微生物數(shù)量、pH等相關(guān),可以作為判斷冷卻豬肉腐敗品質(zhì)變化重要的指標(biāo)。本樣品是分批次購買,且一直放置于-20 ℃儲(chǔ)存,部分檢測時(shí)已放置5 d左右,因此,部分豬肉可能出現(xiàn)少量微生物增加的趨勢,故部分豬肉中有酪胺檢出,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。

表7 豬肉樣品中生物胺的含量(mg/kg)Table 7 Biogenic amines contents of pork samples(mg/kg)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速測定豬肉中9種生物胺的UPLC測定方法。樣品經(jīng)5%三氯乙酸溶液提取后用10 mg/mL丹磺酰氯進(jìn)行衍生,流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L乙酸銨,采用梯度洗脫,流速0.3 mL/min,檢測波長245 nm。結(jié)果表明:采用5%三氯乙酸溶液提取,丹磺酰氯進(jìn)行衍生,應(yīng)用二極管陣列檢測器能滿足豬肉中生物胺的分析檢測要求。色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺和精胺能在10 min內(nèi)得到良好分離,線性范圍為5.0～100.0 μg/mL(r≥0.999),色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺檢出限分別為0.240、0.018、0.095、0.130、0.170、0.290、0.033、0.028、0.080 mg/kg,比國標(biāo)GB 5009.208-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》中規(guī)定的檢出限20 mg/kg低很多。通過對8批市場購買的樣品進(jìn)行檢測,其生物胺總量在(19.40±1.13)～(128.20±0.99) mg/kg,由于本樣品是分批次購買,且一直放置-20 ℃儲(chǔ)存,部分檢測時(shí)已放置5 d左右,因此檢測結(jié)果有差異。本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作簡單、靈敏度高、節(jié)省時(shí)間,且可同時(shí)測定9種生物胺的含量,其平均回收率在70.70%～111.80%之間,樣品回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.33%～9.40%之間,儀器精密度RSD(n=6)≤3.72%,滿足檢測需要,對于豬肉中生物胺的快速批量檢測有較大的實(shí)際應(yīng)用前景,對我國開展食品中生物胺的風(fēng)險(xiǎn)技術(shù)評估和降低生物胺膳食攝入危險(xiǎn)都具有重要參考意義。