無機(jī)硒在干酪乳桿菌和啤酒酵母混合發(fā)酵過程中的相互作用

王 琨,馬成杰,*,胡家勇

(1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436; 2.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖北武漢 430023)

硒元素是動(dòng)物體必需的14大微量營養(yǎng)元素之一,具有抗癌抗氧化、調(diào)壓保肝、提高機(jī)體免疫力的作用,同時(shí)其是硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽過氧化氫酶等多種蛋白的必需組成部分[1-2]。硒元素的缺乏會(huì)引起克山病、大骨節(jié)病;然而過量的硒會(huì)導(dǎo)致機(jī)體中毒,內(nèi)分泌系統(tǒng)損傷,并抑制生長激素和甲狀腺激素合成[3-4]。中國72%以上屬于缺硒地區(qū),每人每天日攝入量低于世界衛(wèi)生組織推薦的最低攝入量50 μg[5]。硒元素在自然界中主要以無機(jī)硒和植物活性硒的形態(tài)存在,在生物體內(nèi)不能長期貯存,需要從飲食中攝取來維持平衡[6-7]。傳統(tǒng)上是通過無機(jī)硒化合物即亞硒酸鈉的口服制劑補(bǔ)硒,但其毒副作用強(qiáng),吸收利用率較低,而生物轉(zhuǎn)化后的有機(jī)硒化合物毒性低,并且能夠更好地激發(fā)機(jī)體的免疫作用[8-9]。酵母被認(rèn)為是富集硒元素的最理想微生物,可以在代謝活動(dòng)中將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)或無毒單質(zhì)形式,且酵母本身含有蛋白質(zhì)、糖類以及B族維生素等豐富的營養(yǎng)物質(zhì),在國外是常規(guī)的膳食補(bǔ)充劑[2]。

大量學(xué)者對于乳酸菌的富硒能力進(jìn)行了研究,如鼠李糖乳桿菌、青春雙歧桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌等[1-2,7]。對于富硒酸奶的研究相對較少:鄭文瑋等[10]以富硒酵母為原料來加工酸乳,但富硒酵母本身即為保健產(chǎn)品,用于工業(yè)生產(chǎn)成本較高;張蓉等[4]和劉東等[11]通過制備富硒的酸奶發(fā)酵劑,進(jìn)一步制作富硒酸奶,而發(fā)酵劑的添加量限制了產(chǎn)品的硒含量,且工序較為復(fù)雜。目前還沒有利用益生菌直接發(fā)酵含有無機(jī)硒的牛乳的相關(guān)報(bào)道。

乳制品已成為人們?nèi)粘ｏ嬍车囊徊糠?經(jīng)過發(fā)酵后的乳制品不僅能夠?qū)⒁嫔鷰肴梭w內(nèi)環(huán)境,同時(shí)添加的功能性物質(zhì)也能夠進(jìn)入人體起到保健作用。本實(shí)驗(yàn)將富硒能力強(qiáng)的啤酒酵母與干酪乳桿菌相結(jié)合，使益生菌在發(fā)酵過程中直接利用無機(jī)硒,探究不同硒濃度與二者混合發(fā)酵復(fù)原乳的相互作用,測定發(fā)酵產(chǎn)品的抗氧化能力變化,并且對混合發(fā)酵過程中無機(jī)硒的轉(zhuǎn)化水平進(jìn)行檢測,以期將乳制品與硒劑相結(jié)合,為開發(fā)有效并且方便的硒補(bǔ)充劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌LC2W(CGMCC No.0828) 光明乳業(yè)研究院;啤酒酵母 安琪酵母股份有限公司;瓊脂、蛋白胨、酵母粉 OXIOD有限公司;脫脂乳粉 恒天然有限公司;亞硒酸鈉、DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic aci,6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)、吐溫-80 SIGMA有限公司;MnSO4·H20、MgSO4·7H20、K2HPO4·3H20、乙酸鈉、檸檬酸二銨、牛肉粉、葡萄糖、氫氧化鈉、乙醇 國藥集團(tuán);硝酸 Merck公司;超純水(MQ水) 自制;YPD培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基自行配制[2,7]。

RW20攪拌器 德國IKA;Bugbox厭氧工作站 英國Ruskinn;MIR-253恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋;UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 日本島津;YX-280D高壓蒸汽滅菌鍋 合肥華泰;超凈工作臺(tái) 美國Labconco;8800 ICP-MS/MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 安捷倫;FE20K pH計(jì)、ME203/02電子天平、ME2002E/02電子天平梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司;優(yōu)普UPT-I-5超純水機(jī) 西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)原乳的制備 將脫脂乳粉溶解在蒸餾水中,攪拌混合均勻,配制成12%(w/w)濃度,分裝100 mL于150 mL三角瓶中,置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)115 ℃滅菌5 min,冷卻備用。測定pH為6.50。

1.2.2 菌種活化 根據(jù)王剛及曾議霆的試驗(yàn)方法[7,12]稍作改動(dòng)。干酪乳桿菌種子液制備:將干酪乳桿菌凍干粉用5 mL 餾水溶解,用接種環(huán)劃線于MRS固體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,用接種環(huán)挑取單菌落放入5 mL MRS液體培養(yǎng)基活化,37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。吸取0.2 mL活化后的菌液置于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。菌液于8000 r/min、4 ℃離心10 min,棄去上清,菌體用無菌生理鹽水洗滌2次后,用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度至OD600=0.7,種子液濃度約為108CFU/mL備用。

啤酒酵母種子液的制備[2,8]:將啤酒酵母的凍干粉分別用5 mL無菌蒸餾水溶解,用接種環(huán)取一環(huán)劃線于YPD固體培養(yǎng)基上,30 ℃厭氧培養(yǎng)24 h取出,用接種環(huán)挑取單菌落放入5 mL YPD液體培養(yǎng)基,30 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。吸取0.2 mL活化后的菌液置于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培,30 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。菌液于8000 r/min、4 ℃離心10 min,棄去上清,菌體用無菌生理鹽水洗滌2次后,用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度至OD600=0.1,種子液濃度約為106CFU/mL備用。

1.2.3 硒發(fā)酵液的配制及發(fā)酵 根據(jù)曾紅等[13]的試驗(yàn)方法做改動(dòng)。在滅菌后的復(fù)原乳中加入亞硒酸鈉溶液,震蕩使其充分混合,使得亞硒酸鈉的終濃度分別為0.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。

將四種濃度的發(fā)酵液分別接種干酪乳桿菌和酵母菌種子液,使得終濃度分別為107和105CFU/mL。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧發(fā)酵12、24、36、48 h并于各時(shí)間點(diǎn)取樣后冷卻至10 ℃以下備用。

1.2.4 pH檢測 用pH計(jì)檢測各組樣品在12、24、36、48 h的pH。

1.2.5 益生菌數(shù)量檢測 根據(jù)Li等[14]的試驗(yàn)方法,將發(fā)酵好的加不同硒含量的發(fā)酵組及對照組混合均勻后分別準(zhǔn)確稱取1 g,用無菌生理鹽水梯度稀釋至適宜濃度,分別用MRS和YPD培養(yǎng)基進(jìn)行平板傾注法計(jì)數(shù),凝固后分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,每組做三個(gè)平行,分別測定12、24、36、48 h的菌數(shù),每組做三個(gè)平行,將平均值以10為底取對數(shù)作圖。

1.2.6 硒轉(zhuǎn)化率的檢測 參考劉嘉坤等[15]和曾議霆等[7]的試驗(yàn)方法,并且稍作改動(dòng)。微波消解:準(zhǔn)確稱取約0.4000 g試樣于聚四氟乙烯消解管中,加10 mL硝酸進(jìn)行微波消解。微波消解程序設(shè)置如下:溫度爬坡10 min升溫至120 ℃,溫度保持5 min;溫度爬坡10 min升溫至190 ℃,保持20 min;冷卻25 min降溫至55 ℃。冷卻后取出,緩慢打開罐蓋排氣,將消解罐放在控溫電熱板上或超聲水浴箱中,于100 ℃加熱30 min或30 ℃ 4000 W超聲脫氣2～5 min,用超純水定容至25或50 mL,混勻備用,同時(shí)用超純水做空白試驗(yàn)。

儀器條件:射頻功率為1500 W;等離子體氣流量15 L/min;載氣量0.8 L/min;輔助氣流量0.40 L/min;霧化室溫度2 ℃樣品提升速率0.3 r/s;采樣深度8～10 nm;重復(fù)三次。

別稀釋標(biāo)準(zhǔn)硒溶液至4、8、12、16、20 μg/L,依次上機(jī)測定,采用內(nèi)標(biāo)法定量,儀器自動(dòng)完成校正曲線。將各時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液離心取上清液,分別用0.22 μm濾膜過濾,過濾好的上清樣品按照以上測定方法上機(jī)進(jìn)行測定,儀器根據(jù)校正曲線自動(dòng)給出硒含量。將各時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液離心取上清液,分別用0.22 μm濾膜過濾,過濾好的上清樣品上機(jī)后利用校正曲線進(jìn)行含量測定。轉(zhuǎn)化的硒含量通過發(fā)酵前原料液的硒含量減去上清中無機(jī)硒含量獲得,即

轉(zhuǎn)化率(%)=(1-上清中硒含量/硒添加量)×100

1.2.7 抗氧化性檢測 參考Li等[14]稍做改動(dòng),將各時(shí)間點(diǎn)加硒組及對照組分別經(jīng)10000 r/min、4 ℃離心10 min,上清用0.22 μm濾膜無菌過濾器過濾備用。取0.1 mL待測加硒組及對照組樣品于3.9 mL DPPH溶液中(DPPH母液10稀釋倍),混合均勻后室溫下避光反應(yīng)30 min,以無水乙醇調(diào)零,在517 nm波長下測定吸光度A1,以無水乙醇代替樣品作為空白組測定吸光度A0,DPPH清除率計(jì)算如下:

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

將Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度稀釋為5、10、20、40 mg Trolox/L溶液,以Trolox濃度為橫坐標(biāo),清除率為縱坐標(biāo)做清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到半清除率(IC50)所對應(yīng)的Trolox值。將各組發(fā)酵液以及過濾除菌后的上清液分別按照上述方法測得IC50,用Trolox當(dāng)量(Trolox E-quivalent Antioxidant Capacity,TEAC,即每克抗氧化物質(zhì)的自由基清除能力相當(dāng)于Trolox的值)衡量各組樣品的抗氧化性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

圖中數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行處理，每組做三次平行，表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉和發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液pH的影響

如圖1所示,隨著發(fā)酵時(shí)間延長,發(fā)酵液的pH均逐步下降,相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)不同硒濃度的pH無顯著差異。說明亞硒酸鈉的添加對干酪乳桿菌和酵母菌產(chǎn)酸能力的抑制作用不明顯。

圖1 亞硒酸鈉濃度和發(fā)酵時(shí)間對pH的影響Fig.1 Effects of different concentration of sodium selenite and fermented time on pH注:不同字母表示顯著差異(p<0.05);圖5同。

2.2 亞硒酸鈉和發(fā)酵時(shí)間對益生菌數(shù)量的影響

如圖2所示,不同硒添加量的發(fā)酵液中干酪乳桿菌數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間延長呈現(xiàn)先增后降的趨勢,菌數(shù)均在36 h達(dá)到峰值,硒添加量從低到高的菌數(shù)分別為4.27×109、3.06×109、2.84×109、2.25×109CFU/g,未添加硒元素的發(fā)酵液中干酪乳桿菌數(shù)量高于添加硒元素的發(fā)酵液,而隨著硒劑濃度的升高,對干酪乳桿菌的增殖起到了明顯的抑制作用。在朱俊辰[16]研究表明嗜酸乳桿菌在添加亞硒酸鈉后生長緩慢,延滯期變長,對數(shù)期縮短,且未添加亞硒酸鈉的菌數(shù)量均高于硒劑組,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。而燕衛(wèi)東[17]對保加利亞乳桿菌對硒耐受能力的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),4 mg/L的亞硒酸鈉對菌種增殖有促進(jìn)作用。

如圖3所示,啤酒酵母菌數(shù)亦呈現(xiàn)先增后降的趨勢,10 mg/kg亞硒酸鈉的發(fā)酵液在24 h達(dá)到峰值;其他各組均在12 h達(dá)到峰值,其中2 mg/kg硒酸鈉的發(fā)酵液高于其他各組,可見2 mg/kg亞硒酸鈉對酵母菌的增殖有促進(jìn)作用。

圖3 亞硒酸鈉濃度和發(fā)酵時(shí)間對酵母菌數(shù)量數(shù)量的影響Fig.3 Effects of concentration of sodium selenite and fermentation time on Saccharomyces cerevisiaecount

2.3 發(fā)酵液的硒轉(zhuǎn)化率檢測

未添加硒元素的上清中硒含量為0,添加硒元素的發(fā)酵液隨著發(fā)酵時(shí)間延長上清中硒含量不斷降低在發(fā)酵24 h內(nèi),發(fā)酵液硒轉(zhuǎn)化率較快,24 h以后達(dá)到98%以上并趨于平緩(圖4)。在0～12 h之間,2 mg/kg劑量組轉(zhuǎn)化最快,其次是5 mg/kg亞硒酸鈉的發(fā)酵液。在12～24 h之間,10 mg/kg亞硒酸鈉的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化率變快,超越了其他兩組。

圖4 加硒組的硒轉(zhuǎn)化率Fig.4 Selenite conversion rate of selenium added groups

2.4 亞硒酸鈉添加量和發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液抗氧化能力的影響

如圖5A所示,隨亞硒酸鈉添加量的增加,相同發(fā)酵時(shí)間下各實(shí)驗(yàn)組上清液抗氧化能力逐漸減弱,發(fā)酵24 h時(shí),相較無外源添加硒元素發(fā)酵液,其他各組上清液的抗氧化能力隨硒濃度升高而顯著降低;發(fā)酵36 h時(shí),除10 mg/kg亞硒酸鈉添加量的發(fā)酵液的上清液外,其抗氧化能力無顯著差異;48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組上清液抗氧化能力無顯著差異。硒劑添加組在24 h上清抗氧化性比未添加組)顯著下降,未添加硒元素的上清液抗氧化性均維持在較高水平,24 h后出現(xiàn)小幅下降。研究表明乳酸菌菌體、胞內(nèi)物質(zhì)及胞外代謝產(chǎn)物(如胞外多糖),均有一定的抗氧化性[18-19]。結(jié)合2.2結(jié)果分析,無外源添加硒元素干酪乳桿菌增殖快,胞外代謝產(chǎn)物積累速率高,使得其上清中的抗氧化性維持在較高水平,添加硒元素之后菌數(shù)增殖慢,但在24 h前菌株對硒元素轉(zhuǎn)化率高,使得上清液中的硒含量降低的,因此24 h時(shí)上清的抗氧化性降低;48 h的菌數(shù)逐漸降低,上清中有害代謝產(chǎn)物積累,抗氧化性下降。

圖5 亞硒酸鈉和發(fā)酵時(shí)間對抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of co ncentration of sodium selenite and fermentation time on antioxidant ability 注:A:上清液的抗氧化能力;B:總抗氧化能力; C:除去上清后干物質(zhì)抗氧化能力。

如圖5B,隨發(fā)酵時(shí)間延長,除添加10 mg/kg亞硒酸鈉的發(fā)酵液外,總抗氧化能力不斷升高;在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi),亞硒酸鈉低添加量(2 mg/kg)的發(fā)酵液抗氧化能力顯著低于高添加量(5、10 mg/kg),可見亞硒酸鈉的添加增加了發(fā)酵液的抗氧化能力。

將總抗氧化能力與上清液抗氧化能力做差值得到干物質(zhì)的抗氧化能力(圖5C),即排除上清中未被轉(zhuǎn)化的亞硒酸鈉,可見干物質(zhì)的抗氧化能力隨硒添加量升高而上升,且添加亞硒酸鈉的發(fā)酵液抗氧化能力主要來源于發(fā)酵后的干物質(zhì),而未添加亞硒酸鈉的發(fā)酵液上清液的抗氧化能力達(dá)到50%以上。由于發(fā)酵液中的亞硒酸鈉被微生物轉(zhuǎn)化利用,轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒或單質(zhì)硒,使得發(fā)酵乳干物質(zhì)的抗氧化能力顯著提高。

3 結(jié)論

本研究以添加無機(jī)硒的復(fù)原乳為原料,利用啤酒酵母和干酪乳桿菌協(xié)同發(fā)酵,研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的亞硒酸鈉在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)對干酪乳桿菌產(chǎn)酸能力的抑制作用不顯著,而對干酪乳桿菌的增殖有一定的抑制作用,且濃度越高,抑制作用越明顯。其對啤酒酵母的增殖并無顯著抑制,相反,2 mg/kg的亞硒酸鈉對啤酒酵母的增殖產(chǎn)生了促進(jìn)作用。在發(fā)酵過程中,亞硒酸鈉的生物轉(zhuǎn)化率在發(fā)酵前24 h不斷升高,之后趨于平穩(wěn),其中2 mg/kg劑量組轉(zhuǎn)化最快;隨亞硒酸鈉濃度不斷增加,其抗氧化能力不斷提高,發(fā)酵乳的總抗氧化能力和除去上清的固體物質(zhì)抗氧化能力均不斷上升。綜合考慮pH,益生菌數(shù)量以及硒轉(zhuǎn)化率結(jié)果,在添加2 mg/kg的亞硒酸鈉發(fā)酵24 h時(shí),發(fā)酵乳性能較好。本研究為含硒的功能性乳品的開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。