龍牙百合腐敗菌的分離鑒定、生物學(xué)特性及抑制劑篩選

尹樂斌 李立才 孟慶霞 周 娟 鄧 鵬 趙良忠

(1. 邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2. 豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地，湖南 邵陽 422000)

百合是百合科百合屬的多年生鱗莖類草本植物，又名野百合、白花百合等，龍牙百合為百合屬野百合的變種[1]。百合是中國傳統(tǒng)的藥食同源植物，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、VB1、VB2、尼克酸等營養(yǎng)物質(zhì)，及鉀、鐵、鋅、硒、銅、錳等微量元素，還含有秋水仙堿、總皂苷、黃酮等活性成分[2]。常食用百合還可降血糖、抗氧化、抗疲勞、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等保健作用[3]。

百合鱗莖貯藏期間易發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了百合的實(shí)際生產(chǎn)，成為制約百合發(fā)展的重要因素之一。已有學(xué)者對百合病原菌分離、鑒定及防治措施做了一定研究，Sara等[4]研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌等菌是引起以色列地區(qū)百合鱗莖腐爛的主要腐敗菌；王艷等[5]對吉林、甘肅等6省的百合鱗莖樣品進(jìn)行病原菌分離鑒定，研究發(fā)現(xiàn)青霉菌、鐮刀菌、木霉、黑根霉、毛霉屬是其中的優(yōu)勢腐敗菌；也有眾多學(xué)者[6-7]對不同地區(qū)百合腐敗菌進(jìn)行分離鑒定，得到不同的優(yōu)勢腐敗菌?？梢姡貐^(qū)不同百合腐敗的優(yōu)勢菌也不盡相同。目前，鮮有學(xué)者[8]對湖南隆回地區(qū)的龍牙百合腐敗菌進(jìn)行研究。本試驗(yàn)擬對該地區(qū)龍牙百合腐敗菌進(jìn)行分離鑒定和生物學(xué)特性研究，并探究常用的9種食品級防腐劑對優(yōu)勢腐敗菌的抑制效果，旨為湖南隆回地區(qū)的龍牙百合的防腐貯藏提供理論及實(shí)踐支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料

供試龍牙百合鱗莖：采自湖南省邵陽市隆回縣，收集后用自封袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保留備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

DNA抽提試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

丙酸鈣、茶多酚、山梨酸鉀：分析純，鄭州康源化工產(chǎn)品有限公司；

丙酸鈉、EDTA-2Na：分析純，南通奧凱生物技術(shù)開發(fā)有限公司；

殼聚糖、納他霉素：分析純，洛陽奇泓生物科技有限公司；

焦亞硫酸鈉：分析純，嘉興久旭化工有限公司；

脫氫乙酸鈉：分析純，安心生物制品有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)滅菌鍋：GI54DWS型，長沙艾迪生物科技有限公司；

超凈工作臺(tái)：SWP-2型，廣州市康恒儀器有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-500型，常州市萬合儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍牙百合腐敗菌的分離及純化 分離過程參照鞏慧玲等[9]的方法并稍作修改，以明顯腐敗的百合組織為分離菌株材料，用接種環(huán)挑取形態(tài)各異的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，將單個(gè)純化菌株進(jìn)行PDA斜面試管接種，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 科赫法則證病 參考文獻(xiàn)[10]并稍作修改，用滅菌解剖針在健康鱗莖上刺孔，將直徑4 mm菌餅貼于孔上，以刺孔但不貼菌餅的鱗莖為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況，再從病變鱗莖中分離純化菌株判定是否為百合腐敗菌。

1.3.3 龍牙百合腐敗菌的形態(tài)特征觀察、鑒定 挑取少許分離純化的菌絲置于PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)，并測量孢子大小，參考《真菌鑒定手冊》[11]記錄的菌落特征描述進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類鑒定。

1.3.4 龍牙百合腐敗菌的現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定 菌株DNA的提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，引物設(shè)計(jì)參考尹樂斌等[12]的方法進(jìn)行，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系和反應(yīng)程序參考White等[13]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物回收、純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序后，進(jìn)行BLAST對比分析。

1.3.5 龍牙百合腐敗菌的生物學(xué)特性研究

(1) 溫度對龍牙百合腐敗菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響：設(shè)置10，15，20，25，30，35，40，45 ℃共8個(gè)不同溫度處理，用點(diǎn)植法接種，每個(gè)處理重復(fù)3次，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，7 d后用血球計(jì)數(shù)板測定產(chǎn)孢量[14]。

(2) pH對龍牙百合腐敗菌菌絲和產(chǎn)孢量的影響：用鹽酸—?dú)溲趸c溶液配制pH值分別為5，6，7，8，9，10，11的PDA培養(yǎng)基，測定方法與1.3.5(1)一致。

(3) 碳、氮源對龍牙百合腐敗菌菌絲和產(chǎn)孢量的影響：以等量碳源的淀粉、葡萄糖、D-木糖、D-果糖、乳糖、甘露醇代替查氏培養(yǎng)基中的蔗糖，配成不同碳源培養(yǎng)基，未添加碳源的培養(yǎng)基作為對照(CK1)；同法以含等量氮源的L-天冬酸、L-苯丙氨酸、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸鉀配置不同氮源的培養(yǎng)基，以無氮源培養(yǎng)基為對照(CK2)，測定方式與1.3.5(1)一致。

(4) 光照對龍牙百合腐敗菌菌絲和產(chǎn)孢量的影響：將接種后的PDA平板分別置于持續(xù)光照、持續(xù)黑暗和12 h光暗交替3種培養(yǎng)條件下，測定方法與1.3.5(1)一致。

(5) 腐敗菌菌絲致死溫度的測定：設(shè)置51，54，57，60，63，66，69 ℃共7個(gè)溫度處理，每個(gè)處理用3個(gè)滅菌試管，在無菌條件下向每個(gè)試管中加入5個(gè)直徑4 mm菌餅，塞好棉塞后在預(yù)設(shè)的恒溫水浴鍋中進(jìn)行加熱，10 min后取出，待冷卻后隨機(jī)從每個(gè)試管里取出3個(gè)菌餅放到PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)菌餅是否長出菌絲判斷致死溫度。

1.3.6 抑制劑對龍牙百合腐敗菌的抑制效果 參考方中達(dá)[15]的方法修改如下：滅菌去離子水，按培養(yǎng)基終濃度制備濃度為3 g/L的抑制劑母液，分別加入2 mL至無菌培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至50 ℃左右培養(yǎng)基18 mL，充分混勻冷卻后，即制成抑制劑最終濃度為300 mg/L培養(yǎng)基平板，同時(shí)做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。接種后在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，按式(1)測量各菌的菌落直徑計(jì)算抑制率[16]。

(1)

式中：

c——抑制率，%；

d1——對照組菌落直徑，mm；

d2——藥劑組菌落直徑，mm。

初篩出對該菌具有顯著抑菌效果的抑制劑，參照程桂林等[17]的試管倍比稀釋法，稍作修改：測定抑制劑的MIC濃度。每支試管加入4 mL滅菌PDA液體，加入4 mL 受試藥物依次倍比稀釋，每種藥物稀釋6個(gè)梯度，第7管添加等量無菌水替代菌液，作為陽性對照，第8管未添加抑制劑，作為陰性對照。將試驗(yàn)菌液用滅菌生理鹽水稀釋成10-6個(gè)/mL濃度，取100 μL分別加入至上述各試管中，混勻后于28 ℃溫箱中培育24 h后觀察結(jié)果。肉眼觀察到澄清透明的試管，其中的抑制劑濃度即為菌株的MIC。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin進(jìn)行繪圖，試驗(yàn)結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍牙百合腐敗菌的分離及純化

在PDA平板上通過平板劃線可以分離、純化出不同形態(tài)的真菌，以肉眼可見的占生長優(yōu)勢的霉菌作為分離純化對象，得到的優(yōu)勢菌記作菌W-1(圖1)。

2.2 科赫法則證病

接種W-1菌株的百合鱗莖均出現(xiàn)明顯的腐敗現(xiàn)象(圖2)。再從腐敗百合進(jìn)行病原分離，獲得與原真菌一樣的菌株。根據(jù)科赫氏法則，證實(shí)菌W-1為百合腐敗菌。

2.3 龍牙百合腐敗菌的形態(tài)特征觀察、鑒定

W-1在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈突起絮狀，菌絲顏色呈白色，基物顏色從第2天到第7天都在不斷變化，主要是從白色變?yōu)檩郎⑻壹t色，再變?yōu)樯钭仙鐖D3(a)、(b)；孢子存在2種分生孢子形態(tài)，小孢子數(shù)目較多，呈長橢圓形、卵形，單細(xì)胞，大小(8～12) μm×(2～3) μm；大孢子數(shù)目較少，呈長橢圓形彎曲，鐮刀狀，兩頭稍尖，如圖3(c)、(d)，初步判定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

圖1 霉菌在龍牙百合上生長

圖2 健康龍牙百合接種菌W-1后的情況

圖3 W-1菌株形態(tài)觀察

2.4 龍牙百合腐敗菌的現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定

測得的rDNA-ITS序列長度為536 bp，經(jīng)過GenBank同源性分析選取相似性最高的7個(gè)菌株，結(jié)果如表1所示。

表1 菌株ITS序列同GenBank中霉菌菌株同源性比較

從表1可以看出，通過ITS序列同源性比較，該菌株與GenBank中7株尖孢鐮刀菌的ITS序列相似性均達(dá)到100%，而且分值最高的全部為尖孢鐮刀菌。根據(jù)同源性比較結(jié)果，可以初步確認(rèn)W-1菌為尖孢鐮刀菌。根據(jù)ITS序列同源性，從GenBank中選擇10個(gè)菌株的ITS基因序列，應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4可知，W-1菌與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum(MH911386.1)在一個(gè)分支中，且W-1和尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum(MH911386.1)的親緣關(guān)系最近，故由形態(tài)和分子鑒定結(jié)果將該菌鑒定為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌，命名為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)W-1。

圖4 以ITS序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的W-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 尖孢鐮刀菌W-1的生物學(xué)特性研究

2.5.1 溫度對菌株W-1菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 由圖5 可知，菌株W-1具有較強(qiáng)的生存能力，在10～40 ℃范圍內(nèi)均可生長、產(chǎn)孢，溫度達(dá)到45 ℃時(shí)菌絲不生長，在30 ℃ 時(shí)菌絲生長最快，5 d后菌落直徑達(dá)62.95 mm，在25 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，7 d后產(chǎn)孢量為4.63×106個(gè)/mL，且顯著(P<0.05)高于其他處理組，與曾富春等[18]和潘虹等[19]的研究結(jié)果一致。

2.5.2 pH對菌株W-1菌絲和產(chǎn)孢量的影響 由圖6可知，在pH 5～11范圍內(nèi)，菌株W-1均能生長、產(chǎn)孢，隨著pH的升高，菌株直徑呈先增加后減小趨勢，在pH 7，8時(shí)菌絲生長最快，生長5 d后菌落直徑達(dá)56.68，57.28 mm，與耿麗華等[20]的研究結(jié)果一致，且隨著pH的繼續(xù)增大，菌落直徑相應(yīng)遞減，但幅度比酸性條件下小，可見，該菌更適宜在中性偏堿性的環(huán)境中生長；pH為7時(shí)，產(chǎn)孢量最大為4.81×106個(gè)/mL，不同pH對該菌產(chǎn)孢影響差異顯著，說明通過將土壤調(diào)至弱酸性可對百合腐敗菌起到一定的抑制作用。

圖5 溫度對菌株W-1菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5.3 碳、氮源對菌株W-1菌絲和產(chǎn)孢量的影響 由表2 可以看出，菌株W-1菌絲在單糖、多糖、糖醇為碳源的培養(yǎng)基中均可生長，說明該菌碳源利用譜較廣。在以葡萄糖和D-果糖為碳源的培養(yǎng)基上生長較快，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)0.05水平上無顯著差異性，與鞏慧玲等[9]研究結(jié)果類似；在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長最慢，甚至比對照組生長更慢，說明甘露醇對于該菌來說并不適合作為碳源使用，與趙杰[21]對于尖孢鐮刀菌的研究結(jié)果有一定差異，可能與菌株和基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同有關(guān)。該菌在以D-木糖為碳源時(shí)，產(chǎn)孢量最大，以葡萄糖、淀粉和D-果糖為碳源時(shí)，三者產(chǎn)孢量無顯著差異，不添加碳源的對照組產(chǎn)孢量最少，說明適合的碳源有助于菌絲生長和產(chǎn)孢。

圖6 pH對菌株W-1菌絲和產(chǎn)孢量的影響

Table2EffectofdifferentcarbonsourcesonmycelialgrowthandsporulationofstrainW-1(n=3)

碳源菌落直徑/mm產(chǎn)孢量/(×106mL-1)葡萄糖56.97±1.32a3.38±0.03b淀粉54.22±1.46b3.43±0.06bD-木糖53.85±1.35b4.06±0.08a乳糖53.80±1.12b1.23±0.06dD-果糖55.20±1.20ab3.33±0.10b甘露醇41.79±0.49d2.33±0.06c對照CK146.76±0.59c1.21±0.08d

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，菌株W-1對不同氮源的利用情況差異顯著，在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，生長5 d后菌落直徑達(dá)到65.13 mm，其次，以蛋白胨和硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基生長速度較快，且兩者無顯著差異，在L-天冬酸為氮源的培養(yǎng)基上生長最慢，甚至比對照組還慢，說明L-天冬酸不適合作為菌株W-1的氮源；該菌在以牛肉膏和L-苯丙酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，7 d后產(chǎn)孢量分別為3.48×106，3.49×106個(gè)/mL，在不添加氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最少，僅2.13×106個(gè)/mL。綜上，牛肉膏更適合該菌株生長，可能是牛肉膏含有多肽類、氨基酸類、核苷酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)，營養(yǎng)成分豐富，可以滿足菌株W-1菌絲的生長需求，而酵母膏、無機(jī)氮源等氮源相對成分單一，提供的營養(yǎng)效果無牛肉膏顯著。

表3氮源對菌株W-1菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響?

Table3EffectofdifferentnitrogensourcesonmycelialgrowthandsporulationofstrainW-1(n=3)

氮源菌落直徑/mm產(chǎn)孢量/(×106mL-1)L-天冬酸31.12±1.10d2.13±0.08dL-苯丙氨酸51.88±0.75c3.49±0.03a蛋白胨57.67±0.67b2.33±0.06b牛肉膏65.13±1.41a3.48±0.03a酵母膏51.75±0.51c2.31±0.12bc硝酸鉀56.07±1.29b2.20±0.08cd對照CK244.78±1.23d2.13±0.06e

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.5.4 光照對菌株W-1菌絲和產(chǎn)孢量的影響 由表4可知，不同光照處理?xiàng)l件下，各組菌絲生長情況不同：在連續(xù)光照條件下，菌絲直徑和產(chǎn)孢量都達(dá)到最大，分別為58.09 mm和3.18×106個(gè)/mL，與其他處理組相比具有顯著差異性(P<0.05)，說明光照有利于該菌生長。

表4光照對菌株W-1菌絲和產(chǎn)孢量的影響?

Table4EffectofdifferentlightonthemyceliumandsporulationofstrainW-1(n=3)

光照條件菌落直徑/mm產(chǎn)孢量/(×106mL-1)連續(xù)光照58.09±0.45a3.18±0.09a連續(xù)黑暗47.08±0.12c2.23±0.08c光暗交替49.44±0.54b2.64±0.06b

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.5.5 菌株W-1菌絲致死溫度的測定 菌株W-1菌絲在51，54，57，60，63 ℃處理10 min還能生長，但在66，69 ℃ 處理10 min后不能生長，說明該腐敗菌菌絲的致死溫度為66 ℃，10 min。

2.6 抑制劑對龍牙百合腐敗菌的抑制效果

抑制劑濃度為300 mg/L時(shí)，由表5可知，納他霉素對菌株W-1的抑菌效果最好，抑制率為95.98%，脫氫乙酸鈉和焦亞硫酸鈉對菌株W-1的抑菌效果次之，抑制率分別為86.97%，86.67%；茶多酚和丙酸鈉與對照組無顯著差異，表明這2種抑制劑對菌株W-1無抑菌效果；其他抑菌劑都有一定抑菌效果，但抑菌效果有限。

采用試管倍比稀釋法測定3種抑制劑的MIC濃度，結(jié)果表明，脫氫乙酸納MIC濃度為150 mg/L，與李忠平等[22]報(bào)道結(jié)果相似，納他霉素、焦亞硫酸鈉MIC濃度分別為125，100 mg/L，目前尚無關(guān)于那他霉素和焦亞硫酸鈉對于尖孢鐮刀菌的抑菌報(bào)道，隋莎莎等[23]、李永才等[24]關(guān)于那他霉素和焦亞硫酸鈉對青霉菌的抑制效果研究，結(jié)果與本試驗(yàn)有差異，可能是試驗(yàn)方法和試驗(yàn)菌株差異或試驗(yàn)誤差所致。

表5 防霉劑對菌株W-1的抑制效果?

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

通過分離純化生長在龍牙百合上的優(yōu)勢腐敗菌，確定了引起湖南隆回地區(qū)的龍牙百合鱗莖腐爛的病原菌為尖孢鐮刀菌，該菌菌絲在30 ℃，pH 7，8條件下生長最快，菌絲致死溫度66 ℃處理10 min；該菌可利用多種碳氮源，其中，在以葡萄糖和淀粉為碳源，牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上生長最塊；在25 ℃、pH 7的情況下產(chǎn)孢量最大，以D-木糖為碳源、牛肉膏和L-苯丙氨酸為氮源的條件下更利于產(chǎn)孢；光照有利于該菌菌絲生長和產(chǎn)孢。9種食品級防腐劑對該菌的抑菌效果表明，納他霉素、脫氫乙酸鈉和焦亞硫酸鈉對該菌具有顯著抑菌效果，MIC濃度分別為150，125，100 mg/L。使用食品級抑菌劑對龍牙百合進(jìn)行抑菌，為生產(chǎn)實(shí)踐中的百合防腐貯藏提供有價(jià)值的指導(dǎo)。本研究后續(xù)工作可分2個(gè)方向進(jìn)行，對初篩抑菌劑試驗(yàn)得到的3種高效抑菌劑進(jìn)行復(fù)配，提升抑菌效果，減少抑菌劑的用量；針對分離出的腐敗菌的生物學(xué)特性進(jìn)行病害的防控工作，如通過調(diào)節(jié)貯藏期的溫度、pH等因子來抑制病原菌生長的效果，最終達(dá)到高效的百合病害防控效果。