高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定人血中8種有毒生物堿Δ

崔佳麗，趙高瓊，梅 晶，張光遠，李斌杰，蔡華丹，蘇 敏，王京昆，劉紅斌#

(1.云南省藥物研究所藥物安全性評價中心，云南 昆明 650111； 2.云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111； 3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室藥物安全性評價中心，云南 昆明 650111； 4.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100039)

生物堿為含氮的有機堿性化合物，其分子中大多含氮雜環(huán)，如吡啶、吲哚、喹啉及嘌呤等，也有部分為胺類化合物，其廣泛存在于生物體內(nèi)，具有高效的藥理作用和毒性作用[1-4]。生物堿具有抗惡性腫瘤[5]、抗腫瘤[6]、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[7]、抗炎[4]、抗菌[8-9]、抗病毒[10]以及抗心律失常和治療高血壓病等心血管疾病[3-4]的作用。但是，生物堿治療窗窄，具有較強毒性，應(yīng)用不當會導(dǎo)致嚴重的毒性反應(yīng)。故臨床應(yīng)用生物堿及相關(guān)藥物時，應(yīng)監(jiān)測生物堿的血藥濃度；發(fā)生生物堿中毒事故時，需對攝入生物堿進行檢測。目前，國內(nèi)外尚未見文獻報道同時監(jiān)測人血中有毒生物堿雪上一枝蒿乙素、介芬胺、藜蘆胺、雪上一枝蒿甲素、雷公藤吉堿、滇烏堿、烏頭堿及黃草烏堿甲的方法，本研究擬建立應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS)法測定人血漿中上述8種有毒生物堿的方法，報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200SL型液相色譜-API3200型三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，Analyte 1.5質(zhì)譜工作站；DV215CD型電子天平(美國OHAUS公司)；Allegra 64R型高速冷凍臺式離心機(美國Backman公司)；XW-80 A型旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司)；MD 200型氮氣吹掃儀(杭州奧盛儀器有限公司)；ElixTM+Milli-Qsynthesis超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

雪上一枝蒿乙素(含量>98%，批號N-019-150906，分子量437.57，北京盛世康普化工技術(shù)研究院提供)；藜蘆胺(含量98.90%，批號SBJ150701，分子量409.61，南京森貝伽生物科技有限公司提供)；介芬胺(含量98.90%，批號SBJ150625，分子量425.60，南京森貝伽生物科技有限公司提供)；雪上一枝蒿甲素(含量100%，批號110895-200404，分子量343.50，中國藥品生物制品檢定所提供)；雷公藤吉堿(含量≥97%，批號150903，分子量857.81，北京盛世康普化工技術(shù)研究院提供)；滇烏堿(含量≥98%，批號151227，分子量659.76，北京盛世康普化工技術(shù)研究院提供)；烏頭堿(含量>98%，批號W-006-151225，分子量645.74，北京萬佳首化生物科技有限公司提供)；黃草烏堿甲(含量99%，批號20151225，分子量643.76，云南省藥物研究所天然藥物化學(xué)研究室自制)；內(nèi)標非那西汀(含量98%，分子量179.22，批號76747319，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司提供)；甲醇(色譜純，美國Merck公司提供)；乙腈(色譜純，美國Merck公司提供)；異丙醇(色譜純，美國Merck公司提供)；醋酸銨(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供)；氨水[分析純，重慶川東化工(集團)有限公司提供]；乙酸乙酯(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供)；超純水。人空白血漿源自云南省昆明市血液中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 未知濃度血漿樣品含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備：分別取雪上一枝蒿乙素、介芬胺、藜蘆胺、雪上一枝蒿甲素、雷公藤吉堿、滇烏堿、烏頭堿和黃草烏堿甲標準品適量，置于10 ml容量瓶中，精密稱定，除烏頭堿加二氯甲烷-異丙醇(V∶V=1∶1)溶解后定容至刻度外，其他對照品均加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度約為0.2 mg/ml的對照品儲備液，2～8 ℃保存。將此儲備液稀釋為相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合對照品工作液，內(nèi)標非那西汀工作液質(zhì)量濃度為2.59 μg/ml。

2.1.2 樣品預(yù)處理：移取內(nèi)標工作液10 μl，常溫(10～30 ℃)條件下以氮氣吹干后移取100 μl未知濃度血漿樣品，渦旋混合2 min，加入25%氨水40 μl，漩渦混勻后以乙酸乙酯1 ml漩渦混合提取3 min，6 000 r/min離心10 min，取出上清液600 μl，常溫條件下以氮氣吹干，殘渣加甲醇150 μl復(fù)溶，離心取上清液。

2.1.3 色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Extend C18色譜柱(4.6 mm×50 mm，3.5 μm)；流動相為乙腈-10 mmol/L醋酸銨(氨水調(diào)pH為8.8)，梯度洗脫(0.00～0.20 min，10.0%～10.0%乙腈；0.20～2.00 min，10.0%～90.0%乙腈；2.00～5.00 min，90.0%～90.0%乙腈；5.00～5.10 min，90.0%～10.0%乙腈；5.10～7.50 min，10.0%～10.0%乙腈)；流速為0.4 ml/min。

2.1.4 質(zhì)譜離子化方式：電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)，正離子模式。(1)多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitor，MRM)定量。雪上一枝蒿乙素定量離子對[M+H]+，m/z=438.20/420.10；介芬胺定量離子對[M+H]+，m/z=426.20/114.10；藜蘆胺定量離子對[M+H]+，m/z=410.20/295.20；雪上一枝蒿甲素定量離子對[M+H]+，m/z=344.30/105.00，雷公藤吉堿定量離子對[M+H]+，m/z=858.60/206.20；滇烏堿定量離子對[M+H]+，m/z=660.30/600.30；烏頭堿定量離子對[M+H]+，m/z=646.30/586.30；黃草烏堿甲定量離子對[M+H]+，m/z=644.20/584.10；內(nèi)標內(nèi)標非那西汀定量離子對[M+H]+，m/z=180.2/110.0。(2)離子源參數(shù)。氣簾氣20.00 psi，噴霧電壓5 500.00 V，霧化溫度500.0 ℃，霧化氣50.0 psi，輔助氣50.0 psi，碰撞氣適中，接口加熱開啟；雪上一枝蒿乙素、介芬胺、藜蘆胺、雪上一枝蒿甲素、雷公藤吉堿、滇烏堿、烏頭堿和黃草烏堿甲質(zhì)譜檢測電壓，去簇電壓分別為65、75、65、85、85、70、75和80 V，射入電壓分別為9、10、9、9、10、9、10和9 V，碰撞室射入電壓為30、15、15、16、30、25、29、20 V，碰撞電壓分別為50、50、40、70、55、50、50和40 V，碰撞室射出電壓分別為6、3、5、3、5、8、5.5和7 V；內(nèi)標內(nèi)標非那西汀質(zhì)譜檢測電壓，去簇電壓為40 V，射入電壓為5 V，碰撞室射入電壓為180 V，碰撞電壓為23 V，碰撞室射出電壓為12 V。

2.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)方法

2.3 方法學(xué)驗證

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局《藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[11]進行方法學(xué)驗證。

2.3.1 特異性考察：本試驗所建立的HPLC-MS/MS條件下，血漿樣品特異性考察結(jié)果見圖1。可見，雪上一枝蒿乙素、介芬胺、藜蘆胺、雪上一枝蒿甲素、雷公藤吉堿、滇烏堿、烏頭堿及黃草烏堿甲等8種檢測目標物和內(nèi)標非那西汀在血漿中的特異性良好，無明顯干擾峰，8種檢測目標物和內(nèi)標非那西汀的保留時間分別為3.19、3.73、3.74、3.79、3.86、3.88、3.94、4.18和3.26 min，表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響8種檢測目標物及內(nèi)標非那西汀的檢測。

2.3.2 線性范圍及定量限：取人空白血漿，加入不同質(zhì)量濃度的雪上一枝蒿乙素、介芬胺、藜蘆胺、雪上一枝蒿甲素、雷公藤吉堿、滇烏堿、烏頭堿和黃草烏堿甲混合標準溶液，按前文所述方法處理后測定。以檢測目標物峰面積和內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標Y，以檢測目標物質(zhì)量濃度為橫坐標X，采用加權(quán)最小二乘法擬合(權(quán)重1/X2)，獲得各檢測目標物于空白人血漿中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、最低定量限(S/N≥10)及最低檢測限(S/N≥3)，結(jié)果見表1，表明各檢測目標物于血漿中在定量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 人血漿樣品中檢測目標物線性回歸方程Tab 1 Equation of linear regression of detection targets in human plasma

2.3.3 殘留率：以線性最高質(zhì)量濃度點樣品-空白血漿樣品順序交叉進樣，計算空白血漿樣品中殘留峰面積與定量下限樣品峰面積的比值，即殘留率。結(jié)果顯示，檢測目標物雪上一枝蒿乙素殘留率為0.66%～1.21%，介芬胺殘留率為0.70%～2.87%，藜蘆胺殘留率為0.00%～2.43%，雪上一枝蒿甲素殘留率為0.90%～1.80%，雷公藤吉堿殘留率為0.55%～0.55%，滇烏堿殘留率為0.36%～0.72%，烏頭堿殘留率為0.36%～1.06%，黃草烏堿甲殘留率為0.26%～0.54%，內(nèi)標非那西汀殘留率為0.11%～0.19%，表明殘留率不影響樣品的檢測。

2.3.4 精密度和準確度試驗：處理檢測目標物最低定量限及3個質(zhì)量濃度血漿質(zhì)控樣本3批，每批每個質(zhì)量濃度6份，計算日內(nèi)、日間精密度與準確度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明方法精密度和準確度均滿足生物樣品定量分析要求。

2.3.5 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)：分別處理3個質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品，每個質(zhì)量濃度6份，與對應(yīng)質(zhì)量濃度標準溶液比較，計算提取回收率。處理低、中和高3個質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控基質(zhì)樣品，每個質(zhì)量濃度6份，與對應(yīng)質(zhì)量濃度標準溶液比較，計算歸一化基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)=(基質(zhì)效應(yīng)樣品峰面積/標準溶液峰面積)×100%；歸一化基質(zhì)效應(yīng)=(目標物基質(zhì)效應(yīng)/內(nèi)標基質(zhì)效應(yīng))×100%，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，該方法的提取回收率較高，回收率及基質(zhì)效應(yīng)對不同質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的分析檢測影響一致，故可忽略基質(zhì)效應(yīng)對分析檢測的影響，提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)符合生物樣本分析檢測要求。

2.3.6 穩(wěn)定性考察：8種生物堿血漿質(zhì)控樣品于待考察條件下的穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，處理后血漿質(zhì)控樣品于常溫放置5 d后，雪上一枝蒿乙素、介芬胺、藜蘆胺、雪上一枝蒿甲素、雷公藤吉堿、滇烏堿、烏頭堿及黃草烏堿甲測定濃度與理論濃度的RSD為6.42%～13.15%，測定濃度與理論濃度的RE為-11.29%～9.48%。未處理血漿質(zhì)控樣品于常溫存放6 h測定濃度的RSD為3.88%～9.74%，測定濃度與理論濃度的RE為-5.69%～6.60%；-80 ℃存放5 d及-80 ℃存放5 d內(nèi)反復(fù)凍融3次后，測定濃度的RSD為4.09%～14.01%，測定濃度與理論濃度的RE為-12.70%～10.10%。除烏頭堿外，其他7種生物堿于-80 ℃存放173 d及-80 ℃存放173 d內(nèi)反復(fù)凍融3次后，測定濃度的RSD為4.42%～12.75%，測定濃度與理論濃度的RE為-9.51%～14.37%；烏頭堿于-80 ℃存放173 d及-80 ℃存放173 d內(nèi)反復(fù)凍融3次后，測定濃度與理論濃度的RE分別為(-39.13±4.46)%、(-39.03±2.31)%。結(jié)果表明，除烏頭堿外，其他7種生物堿血漿質(zhì)控樣品于上述穩(wěn)定性考察條件下均穩(wěn)定，符合生物樣品測定要求；烏頭堿于-80 ℃存放173 d及-80 ℃存放173 d內(nèi)反復(fù)凍融3次不穩(wěn)定，為避免對其分析檢測的準確性造成影響，烏頭堿血漿樣品不宜長期存儲。

3 討論

因檢測目標物均為生物堿類化合物，故血漿樣品前處理過程中先采用氨水堿化，分別對加入濃氨水10 μl、25%氨水20 μl和25%氨水40 μl進行考察。結(jié)果顯示，加入濃氨水10 μl堿化后，雪上一枝蒿甲素、介芬胺、滇烏堿和黃草烏堿甲回收率均為60%～70%，推測為濃氨水沉淀蛋白造成檢測目標物被裹挾沉淀；與加入25%氨水20 μl堿化比較，加入25%氨水40 μl堿化后，雪上一枝蒿乙素、滇烏堿的回收率提高約10%，黃草烏堿甲的回收率提高約20%。分別對提取溶劑正己烷-二氯甲烷-異丙醇(V∶V∶V=20∶10∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯(V∶V=1∶5)、二氯甲烷-乙酸乙酯(V∶V=1∶10)、二氯甲烷-乙酸乙酯(V∶V=2∶5)和乙酸乙酯進行考慮，結(jié)果顯示，各生物堿應(yīng)用乙酸乙酯提取的回收率最優(yōu)。另外，采用2倍乙腈沉淀前處理法時各生物堿的回收率與建立方法相近，但乙酸乙酯提取法檢測限約為乙腈沉淀法的1/2，為優(yōu)化檢測方法的靈敏度，選用25%氨水堿化、乙酸乙酯提取法。

A.空白血漿樣品；B.空白血漿加入8種檢測目標物與內(nèi)標非那西汀(2.59 μg/ml)；C.雪上一枝蒿乙素；D.介芬胺；E.藜蘆胺；F.雪上一枝蒿甲素；G.雷公藤吉堿；H.滇烏堿；I.烏頭堿；J.黃草烏堿甲；K.內(nèi)標非那西汀A.blank plasma sample；B.detection targets and phenacetin(2.59 μg/ml)add to the blank plasma；C.bullatine B；D.jervine；E.veratramine；F.bullatine A；G.wilforgine；H.yunaconitine；I.aconitine；J.vilmorrianine A；K.internal standard article phenacetin圖1 血漿樣品特異性考察(離子流圖)Fig 1 Inspection on specificity of plasma sample

因建立方法同時檢測的目標物較多，且出峰時間較為接近，峰寬較窄，均約為0.1～0.2 min，致使全時間段范圍掃描所獲得色譜圖中目標峰掃描點數(shù)不足以穩(wěn)定定量。故分別根據(jù)8種檢測目標物及內(nèi)標具體出峰時間，摸索確定分時間段掃描模式，從而使檢測方法更為穩(wěn)定。

表2 精密度和準確度試驗結(jié)果Tab 2 Results of precision and accuracy tests

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Tab 3 Results of extraction recovery and matrix effect

8種有毒生物堿均采用正離子檢測模式。流動相中加入適量酸有利于檢測目標物的電離[12]。因此，對流動相中加入0.01%甲酸、0.1%甲酸、1%甲酸、0.01%甲酸和2 mmol/L醋酸銨進行考察。結(jié)果顯示，上述流動相條件下，僅見雷公藤吉堿、滇烏堿色譜峰，其他化合物響應(yīng)極低或未見，表明流動相酸性條件下無法實現(xiàn)8種檢測目標物的同時檢測。以0.04%氨水(pH=8.0～9.0)、2 mmol/L醋酸銨(氨水調(diào)pH=9.0)為水相，各生物堿均有響應(yīng)，但滇烏堿出現(xiàn)雙峰，黃草烏堿甲拖尾嚴重；變更流動相為乙腈-10 mmol/L醋酸銨(氨水調(diào)pH=8.8)，各生物堿峰形較優(yōu)，且響應(yīng)較前述流動相均有提高。

綜上所述，本研究建立的HPLC-MS/MS測定人血漿中8種有毒生物堿的方法，可靈敏、準確和穩(wěn)定地測定人血漿中微量/痕量8種有毒生物堿的濃度，可達到生物樣品檢測的要求，可為臨床8種有毒生物堿及相關(guān)藥物的藥物濃度監(jiān)測及毒性檢測判斷提供技術(shù)支撐。