菊酯農(nóng)藥微生物降解的異構(gòu)體選擇性特征

張亞杰 李劭彤 李朝陽(yáng) 羅湘南 田晶 李巧玲

摘要：從農(nóng)藥廠排放污泥中篩選分離得到1株可以以甲氰菊酯為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株W-10，經(jīng)鑒定為糞產(chǎn)堿桿菌?？疾炱鋵?duì)甲氰菊酯（FP）、氯菊酯（PM）和高效氟氯氰菊酯（β-CF）的降解特征，降解半衰期分別為5.06、3.40、4.03 d，重點(diǎn)研究菌株W-10對(duì)不同異構(gòu)體和對(duì)映體的降解差異。結(jié)果表明，3種菊酯雖然結(jié)構(gòu)相近，但氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的順?lè)串悩?gòu)體呈現(xiàn)不同的降解選擇性，菌株W-10分別優(yōu)先降解氯菊酯的順式體和高效氟氯氰菊酯的反式體;此外，菌株W-10對(duì)對(duì)映體的降解選擇性則主要體現(xiàn)在高效氟氯氰菊酯反式異構(gòu)體所包含的一對(duì)對(duì)映體上。

關(guān)鍵詞：甲氰菊酯;氯菊酯;高效氟氯氰菊酯;微生物降解;異構(gòu)體;對(duì)映體;選擇性降解行為

中圖分類(lèi)號(hào)： X132;X592? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0278-03

擬除蟲(chóng)菊酯是人工合成的一類(lèi)仿生農(nóng)藥，廣泛用作農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑。菊酯農(nóng)藥種類(lèi)較多，結(jié)構(gòu)也較類(lèi)似，大多數(shù)含有1個(gè)或者多個(gè)手性中心，立體結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，一般包含2個(gè)以上順?lè)串悩?gòu)體，同時(shí)每個(gè)順式或反式異構(gòu)體又含有1對(duì)對(duì)映異構(gòu)體。研究表明，不同的菊酯異構(gòu)體，其殺蟲(chóng)活性及對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性往往存在很大差異[1-2]。同時(shí)當(dāng)菊酯施用到田間后，不同異構(gòu)體在環(huán)境中的消解也顯示出很大的不同，這種差異主要是由環(huán)境微生物的代謝作用造成[3-4]。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)菊酯在環(huán)境中對(duì)對(duì)映體或異構(gòu)體的選擇性降解有很多研究[5-7]，但從微生物水平上考察單一微生物菌株對(duì)菊酯異構(gòu)體的降解差異，則只有很少的報(bào)道[8-9]。本研究從農(nóng)藥廠污泥中篩選得到1株菊酯的優(yōu)勢(shì)降解菌株，研究其對(duì)甲氰菊酯（FP）、氯菊酯（PM）和高效氟氯氰菊酯（β-CF）（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）的降解行為，重點(diǎn)考察其對(duì)不同異構(gòu)體和對(duì)映體的降解特征。相關(guān)研究結(jié)果有助于闡釋菊酯農(nóng)藥在環(huán)境中的對(duì)映體選擇性降解行為，同時(shí)可為菊酯農(nóng)藥的微生物強(qiáng)化修復(fù)提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

污泥取自河北省石家莊某農(nóng)藥廠;甲氰菊酯乳油（89%）由河北威遠(yuǎn)生物化工股份有限公司惠贈(zèng);甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品（98%）購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究所;正己烷、乙酸乙酯、異丙醇等購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，均為色譜純。本試驗(yàn)于2016年在河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 1 g、KH2PO4 1 g、水 1 000 mL（pH值為7.0～7.2）;普通培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL（pH值為7.0～7.2）;基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NH4NO3 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、（NH4）2SO4 0.50 g、KH2PO4 0.50 g、NaCl 0.50 g、K2HPO4 1.50 g、酵母浸粉0.05 g、水1 000 mL（pH值為7.0～7.2），固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入2%瓊脂粉。

1.3 試驗(yàn)儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀（帶G1314B紫外檢測(cè)器）、超凈工作臺(tái)、超聲波清洗器、pH計(jì)、搖床、滅菌鍋等。

1.4 菊酯降解菌的篩選

將100 mL含甲氰菊酯農(nóng)藥（100 mg/L）的富集培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，滅菌、冷卻后加入污泥10 g，于30 ℃、180 r/min下?lián)u床培養(yǎng)7 d，此后按10%的接種量轉(zhuǎn)接到下一批含甲氰菊酯（質(zhì)量濃度依次為100、200、300、400、500 mg/L）的富集培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度在相同條件下培養(yǎng)7 d后，再按10%的接種量轉(zhuǎn)接到含甲氰菊酯為500 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，此后進(jìn)行梯度稀釋并涂布到普通固體培養(yǎng)基上，反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，直至得到單菌落，將單菌落進(jìn)行甘油管保存，最終得到3株優(yōu)勢(shì)菌株。通過(guò)后續(xù)甲氰菊酯降解試驗(yàn)，選擇降解性能最好的1株進(jìn)行詳細(xì)研究，命名為W-10。

1.5 菌種鑒定

將稀釋好的菌液涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出后，采用革蘭氏染色以及芽孢染色后鏡檢。另外進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)等生理生化鑒定[10]，并提取菌株DNA擴(kuò)增后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將16S rDNA的序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性對(duì)比[11]。

1.6 降解效能的測(cè)定

以W-10菌株為種菌，進(jìn)行菌液配制，以接菌量5%（菌液D600 nm≈0.5）接種到裝有100 mL含10 mg/L甲氰菊酯的無(wú)菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入1 mL吐溫-20，以含相同濃度無(wú)菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照，在30 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8 d取樣，使用液相色譜進(jìn)行總量及手性測(cè)定。氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的降解測(cè)定試驗(yàn)與甲氰菊酯相同。色譜條件為非手性高效液相色譜（HPLC）的色譜柱為正相硅膠柱（購(gòu)自大連伊利特分析儀器有限公司，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為正己烷 ∶ 異丙醇=100 ∶ 0.08（體積比）;手性HPLC色譜柱、甲氰菊酯和高效氟氯氰菊酯為Chiralcel OD-H（購(gòu)自日本大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社，250 mm×4.6 mm），氯菊酯為Chiralcel OJ-H（購(gòu)自日本大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相均為正己烷 ∶ 異丙醇=100 ∶ 2（體積比）。非手性和手性HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)均為230 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。具體色譜分析方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

菌株W-10是能以甲氰菊酯為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，該菌屬革蘭氏染色陰性短桿菌，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)為陰性，甲基紅試驗(yàn)為陰性，常成單、雙或成鏈狀排列，無(wú)芽胞，專(zhuān)性需氧。W-10菌株測(cè)定的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 499 bp，與糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）AU02的同源相似性達(dá)99%，初步鑒定為產(chǎn)堿菌屬中的糞產(chǎn)堿桿菌。

2.2 菊酯降解菌降解條件的優(yōu)化

分別調(diào)節(jié)溫度為10、20、30、40 ℃，pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接菌量為0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%，于180 r/min下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后取樣測(cè)定降解率，進(jìn)行條件優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，該菌的最適生長(zhǎng)條件為溫度30 ℃、pH值7.0、接菌量5.0%，后續(xù)的菊酯降解試驗(yàn)均在該條件下進(jìn)行。

2.3 菊酯順?lè)串悩?gòu)體的降解選擇性

菌株W-10對(duì)3種菊酯的降解結(jié)果見(jiàn)表1。3種菊酯的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，按異構(gòu)體總量計(jì)，甲氰菊酯、氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的降解半衰期分別為5.06、3.40、4.03 d，降解快慢順序?yàn)槁染挣?高效氟氯氰菊酯>甲氰菊酯。

甲氰菊酯、氯菊酯和高效氟氯氰菊酯分別含有1、2、3個(gè)手性中心，因此甲氰菊酯含有2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，無(wú)順?lè)串悩?gòu)體。氯菊酯和高效氟氯氰菊酯均含有1個(gè)順式異構(gòu)體和1個(gè)反式異構(gòu)體，順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體又分別含2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，因此共有4個(gè)對(duì)映體。表1中也列出了氯菊酯和高效氟氯氰菊酯順?lè)串悩?gòu)體的降解數(shù)據(jù)，氯菊酯和高效氟氯氰菊酯存在明顯的順?lè)串悩?gòu)體選擇性。氯菊酯的順式體降解明顯快于反式體，順?lè)串悩?gòu)體半衰期分別為2.68、4.36 d，同時(shí)用立體異構(gòu)體比率（stereoisomer ratio，簡(jiǎn)稱(chēng)SR）表示順式體和反式體的濃度比值，降解過(guò)程中氯菊酯的SR值逐漸減小，從 0 d 的1.19減小到8 d的0.54。高效氟氯氰菊酯順式體降解明顯慢于反式體，半衰期分別為4.48、3.59 d，降解過(guò)程中其SR值從0 d的1.20逐步增大到8 d的1.57。圖2給出了氯菊酯和高效氟氯氰菊酯降解0、8 d時(shí)的分離色譜圖，可以清楚地看出cis-PM和trans-β-CF分別是2種菊酯降解較快的異構(gòu)體。因此，W-10菌株對(duì)氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的順?lè)串悩?gòu)體有著不同的降解選擇性。

高效氟氯氰菊酯與氯菊酯在結(jié)構(gòu)上只有很小的差異（圖1），前者僅比后者多1個(gè)氰基和氟原子，因此結(jié)構(gòu)上的微小差異可能會(huì)對(duì)化合物的異構(gòu)體選擇性帶來(lái)較大影響，具體的微生物降解機(jī)制仍有待深入研究。同時(shí)，菊酯在土壤試驗(yàn)中，一般均為反式異構(gòu)體快于順式異構(gòu)體[7，13]，而本研究中 W-10 菌株對(duì)氯菊酯順式體降解快于反式體，與土壤試驗(yàn)相反，高效氟氯氰菊酯順?lè)词襟w的降解選擇性則與土壤試驗(yàn)一致，這可能是由于土壤中的降解微生物有很多種，而本研究中僅為其中一種菌株的降解，土壤中不同的微生物菌群應(yīng)該有不同的降解特征，農(nóng)藥降解為各種微生物的綜合代謝作用。

2.4 菊酯對(duì)映異構(gòu)體的降解選擇性

菊酯所包含的對(duì)映異構(gòu)體結(jié)構(gòu)十分相近，只能在手性色譜柱上得到拆分，筆者所在課題組先期工作已研究了菊酯的手性拆分，并確定了各對(duì)映體的流出順序[14]。本研究在手性柱上測(cè)試W-10菌株對(duì)各菊酯對(duì)映體的降解情況，并定義對(duì)映體比率（enantiomer ratio，簡(jiǎn)稱(chēng)ER）為先流出對(duì)映體與后流出對(duì)映體的濃度比值，具體結(jié)果見(jiàn)表2。甲氰菊酯和氯菊酯的ER值始終為1.00左右，說(shuō)明對(duì)映體降解速率基本一致，沒(méi)有選擇性。高效氟氯氰菊酯順式異構(gòu)體所含的1對(duì)對(duì)映體也沒(méi)有降解選擇性，而反式異構(gòu)體則顯示出一定的對(duì)映體選擇性 其ER值從0 d的0.99逐漸增大 到8 d時(shí)為1.13，說(shuō)明色譜柱上先流出的1R-trans-β-CF降解略慢于后流出的1S-trans-β-CF，具體的手性分離色譜圖見(jiàn)圖3，2種對(duì)映體的半衰期分別為3.77、3.43 d。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，微生物菌株對(duì)菊酯的降解選擇性與菊酯的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，化合物結(jié)構(gòu)的微小差異可能造成異構(gòu)體選擇性的根本不同，因此研究微生物對(duì)手性污染物的降解和修復(fù)時(shí)，必須將不同異構(gòu)體分別進(jìn)行考察，其原因可能與微生物體內(nèi)降解酶的特定手性結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體的作用機(jī)制仍有待深入研究。同時(shí)，微生物的手性降解可以更加有針對(duì)性地降解手性污染物的特征異構(gòu)體，因此采用適宜的微生物菌株，有利于提高環(huán)境污染中手性農(nóng)藥的降解修復(fù)效果。

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