無患子抗稻瘟病病菌活性皂苷的分離與鑒定

彭玉萌 霍光華 譚明輝 陳緒濤 肖大瑾

摘要：探索無患子抗稻瘟病病菌的活性成分，運用大孔吸附樹脂及硅膠柱層析對無患子皂苷進行分離純化，采用薄層色譜法和高效液相色譜法定性、光度比色法定量、核磁共振和質(zhì)譜法確定結(jié)構(gòu)、瓊脂稀釋法評價抗稻瘟病病菌活性。結(jié)果顯示，無患子提取物過D101大孔吸附樹脂的70%乙醇洗脫液，再經(jīng)過硅膠柱，收集到由三氯甲烷-甲醇（體積比分別為1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1、7 ∶ 1、9 ∶ 1）洗脫下來的5個活性組分，該5個組分的抗稻瘟病病菌EC50分別為46.84、5119、23.13、29.92、40.85 μg/mL。進一步純化7 ∶ 1、5 ∶ 1流分，分別獲得1個單體成分和含有2種成分的混合物，在濃度為20 μg/mL時，抗菌率分別為84.16%、81.24%。該單體結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜分析和文獻比對被鑒定為常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

關(guān)鍵詞：無患子;皂苷;分離;抗稻瘟病病菌活性

中圖分類號： S435.111.4+1;S482.2+92? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0127-04

無患子（Sapindus mukorossi）正如其名的含義“無病之果”，該植物有著廣泛的藥用價值，果實可治療過度流涎、丘疹、癲癇、萎黃病、偏頭痛、濕疹、牛皮癬等，種子粉可治療齲齒、關(guān)節(jié)炎、普通感冒、便秘、作嘔等，種子可去皮膚黃褐色和雀斑、清洗皮膚油性分泌物、制洗發(fā)劑等，葉可用于浴池減緩關(guān)節(jié)痛，根可治療痛風(fēng)、風(fēng)濕病等[1]。已發(fā)現(xiàn)無患子提取物具有抑制光滑念珠菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌[2]、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、幽門螺旋桿菌等細菌的活性，而且幽門螺旋桿菌等菌不會對該提取物產(chǎn)生抗性[3]，還可以抑制黑曲霉[4]、苜宿炭腐病病菌和黃連白絹病病菌（EC50為181～407 μg/mL）[5]等的活性。研究發(fā)現(xiàn)，無患子中果皮總皂苷提取物具有強烈抑制稻瘟病病菌的活性，而無患子皂苷種類豐富，其中果實中含有13種五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷[5-9]，根中含有2種五環(huán)三萜類甘遂烷型皂苷[10-11]，蟲癭中含有7種達瑪烷型皂苷和5種甘遂烷型皂苷[12-13]，而且新的皂苷還在不斷地被發(fā)現(xiàn)[14]。為了尋覓其生防活性皂苷先導(dǎo)物，本試驗對其進行分離探索，并進行色譜光譜定性定量分析以及活性跟蹤。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

本試驗于2017年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省菌物資源保護與利用重點實驗室開展。無患子中果皮浸膏由南昌市生物資源保護與利用重點實驗室制備[15]。

GF254薄層硅膠板，購自山東省煙臺市芝罘化工廠;D101型大孔樹脂，購自天津市南開大學(xué)化工廠;柱層析用硅膠（精致型），購自青島海洋化工廠分廠。高效液相色譜儀，購自Waters公司;核磁共振波譜儀，400 MHz NMR波譜儀，購自Bruker公司;UPLC-ESI-QTOF質(zhì)譜儀，購自安捷倫科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大孔吸附樹脂初分無患子抗稻瘟病病菌活性成分 醇洗脫梯度的選擇：吸取15 mL無患子浸膏的正丁醇萃取物，緩慢上樣至D101型大孔吸附樹脂柱中，依次用2倍柱體積（BV）的體積分數(shù)為0、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液過柱，流速為2 mL/min，收集各流分。分別測定各流分的皂苷含量、固形物含量以及抗稻瘟病病菌活性。

洗脫劑用量的確定：吸取15 mL正丁醇萃取物，緩慢上樣至D101型大孔吸附樹脂柱中，依次用蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各4 BV洗脫。以1 BV/份收集流分，測定各流分中固形物含量和無患子皂苷的含量。

1.2.2 硅膠柱色譜分離無患子抗稻瘟活性成分 稱取90 g 200～300目的硅膠，用三氯甲烷浸泡24 h后，濕法裝柱。量取10 mL經(jīng)大孔吸附樹脂洗脫的70%流分，分別按三氯甲烷、甲醇體積比為9 ∶ 1、7 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1進行梯度洗脫，每個梯度2 BV，每50 mL洗脫液收集1份。蒸干后，測定各洗脫流分在濃度為50 μg/mL時對稻瘟病病菌的抑菌活性。

1.2.3 皂苷成分分析及波譜數(shù)據(jù)測定 薄層色譜分析（TLC）檢測：將過硅膠柱后的各流分用毛細管點樣于薄層板上，點樣后用吹風(fēng)機吹干，然后放入加有三氯甲烷和甲醇體積比為7 ∶ 3的展開劑層析缸中，封上蓋子，待展開至距離薄層板頂端1 cm左右時取出，用吹風(fēng)機吹干，然后噴上10% H2SO4溶液，加熱顯色。

高效液相色譜分析（HPLC）檢測：將過硅膠柱后的各流分減壓濃縮，冷凍干燥至干，分別稱取少量樣品，用色譜純級的甲醇溶解，過0.45 μm濾膜，然后以乙腈和水為流動相，梯度洗脫，檢測無患子皂苷的純度。色譜柱為C18柱，4.6 mm×150 mm;柱溫為25 ℃;檢測波長為205 nm;流動相：A泵是乙腈，B泵是水。梯度洗脫程序為0～5 min，30% A;5～6 min，30%～50% A;6～40 min，50%～70% A;40～60 min，70%～100% A。流速為2 mL/min;進樣量為20 μL。

核磁譜圖在Bruker公司400 MHz NMR波譜儀上測定，以四甲基硅為內(nèi)標物，化學(xué)位移單位為10-6，耦合常數(shù)單位為Hz。

1.2.4 皂苷含量的定量分析 標準曲線的繪制：稱取 10.0 mg 干燥的齊墩果酸，用甲醇溶解并定容至10 mL，備用;稱取0.500 0 g香草醛，用冰乙酸溶解并定容至10 mL，備用;分別吸取齊墩果酸甲醇溶液0、40、80、120、160、200、240 μL于比色管中，每組3次重復(fù)，水浴加熱揮去溶劑，先后加入 0.4 mL 配好的香草醛-冰醋酸溶液，1.4 mL高氯酸（氧化劑），充分搖勻，于70 ℃水浴加熱20 min，取出后立即浸入冰水浴中冷卻2～3 min，加入10 mL冰乙酸，在546 nm波長處測定其吸光度[16]。用移液槍吸取一定體積的分離液，測定樣品分離液的吸光度（用標準曲線法），以不加提取液為空白對照，計算提取液中的皂苷含量。

1.2.5 抗稻瘟病病菌活性測定 將水稻稻瘟病病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，備用。用直徑為7 mm的打孔器打取菌落邊緣的菌塊作為接種物，分別接種預(yù)先制備的含不同濃度無患子皂苷的PDA平板上，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測定菌落大小，并算出抑菌率：

抑菌率=（空白菌落直徑-含藥菌落直徑）/（空白菌落直徑-接入菌塊直徑）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂對無患子皂苷的初步分離效果

2.1.1 不同濃度乙醇水溶液的洗脫分離效果 由表1可知，無患子粗皂苷經(jīng)D101大孔吸附樹脂分離后，其皂苷主要集中于70%、50%、95%乙醇洗脫液中，蒸餾水和30%乙醇洗脫液中雖然有一定的固形物存在，但并未檢測出皂苷，這說明其中的固形物有可能是糖類等水溶性雜質(zhì)。因此，蒸餾水和低濃度乙醇可以用來除掉無患子粗皂苷中的雜質(zhì)。

2.1.2 洗脫劑用量對分離效果的影響 由表2可知，在用 3 BV 的蒸餾水洗脫時，已經(jīng)能將萃取物中的水溶性雜質(zhì)除盡，再繼續(xù)用蒸餾水洗脫，則沒有物質(zhì)被洗脫下來;30%乙醇洗脫用量至3 BV時，在流分中未檢測到無患子皂苷，當用量達到4 BV時，開始有無患子皂苷，說明無患子皂苷隨著30%乙醇用量的增加，已有部分被解吸，因此，30%乙醇的用量確定為3 BV;當70%乙醇的用量為4 BV時，已經(jīng)能夠洗下所有皂苷。因此，選擇D101大孔吸附樹脂純化無患子皂苷的工藝為蒸餾水和30%乙醇各3 BV，70%乙醇4 BV，依次洗脫，收集70%乙醇洗脫液。由表3可計算出，70%乙醇流分抗稻瘟病病菌的毒力方程為y=2.220 0x+1.390 8（r2=0.987 2，P=0.001 7），EC50=42.245 4 μg/mL，EC90=159.610 0 μg/mL。

2.2 硅膠柱色譜對無患子皂苷的分離效果

2.2.1 硅膠柱不同比例二元洗脫劑洗脫的無患子皂苷流分的抗稻瘟病病菌活性 由表4可知，三氯甲烷與甲醇二元洗脫劑的體積比為5 ∶ 1、7 ∶ 1時，其EC50較小，分別為 23.132 5、29.918 7 μg/mL，而其他體積比的EC50均高于 40 μg/mL，說明主要活性物質(zhì)可能在這2個流分中。另一方面，EC90似乎表現(xiàn)出極性越弱的流分活性越強的趨勢，即含糖基越少的無患子皂苷活性越強。

2.2.2 硅膠柱不同比例二元洗脫劑洗脫的無患子皂苷流分的色譜結(jié)果 由圖1可知，大孔吸附樹脂70%乙醇流分所含皂苷成分較多，至少有5個化合物。經(jīng)過硅膠柱層析，各比例三氯甲烷和甲醇洗脫后，能夠得到有效分離。1 ∶ 1和3 ∶ 1流分似乎成分相對單一，但活性較弱，而活性較強的5 ∶ 1流分似有3個成分，7 ∶ 1、9 ∶ 1流分均有2個以上化合物。

2.2.3 無患子皂苷的純化及其抗稻瘟病菌活性 向5 ∶ 1流分的三氯甲烷-甲醇溶液中加入蒸餾水，有白色絮狀物出現(xiàn)，離心收集白色絮狀物，棄去上清液，獲得了白色粉末狀成分，經(jīng)色譜純甲醇溶解沉淀，HPLC檢測，獲得了含有2個主峰的混合物A（圖2-a）。將7 ∶ 1流分重新上硅膠柱，進一步細分三氯甲烷和甲醇的比例，得到了白色晶體狀物質(zhì)，經(jīng)HPLC檢測，獲得1個單體化合物B（圖2-b）。2個物質(zhì)在濃度為 20 μg/mL 時，對稻瘟病病菌的抑制率分別為81.24%（圖2-c）、84.16%（圖2-d）。

2.3 活性無患子皂苷的鑒定

活性無患子皂苷單體的結(jié)構(gòu)式如圖3所示，為白色晶狀單體。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ 0.73，0.84，0.93，0.96，0.99，1.20（3H，each，all s，24，26，29，30，25，27-H3），1.63（1H，m，9-H），1.90（1H，m，11-H），2.86（1H，dd，J=17.03，9.30 Hz，18-H），3.28，3.22（2H，both d，J=11.03，23-H2），3.64（1H，dd，J=6.32，4.10 Hz，3-H），4.47（1H，d，J=7.2 Hz，1″-H），4.50（1H，d，J=6.88 Hz，1′-H），5.16（1H，t，12-H），5.22（1H，brs，s，1″-H）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ 182.31，145.21，123.26，106.34，104.51，101.16，82.11，81.92，77.42，76.00，75.04，74.01，72.73，71.43，70.87，69.72，69.65，66.94，65.31，64.39，47.95，47.93，47.55，47.13，43.76，42.79，42.59，40.30，39.47，37.42，34.76，33.7，33.41，33.22，31.42，28.67，26.38，26.27，24.32，23.91，23.82，18.62，17.84，17.81，16.20，13.60。HR-ESI-MS：m/z 882.497 7[M+H]+（calcd for C46H74O16，882.497 7）。與文獻比對該單體的結(jié)構(gòu)被確定為常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

3 結(jié)論

無患子中果皮總皂苷浸膏正丁醇溶出物經(jīng) D101 大孔樹

脂的70%乙醇水溶液洗脫，洗脫物再經(jīng)硅膠柱層析，分別收集三氯甲烷和甲醇體積比為5 ∶ 1、7 ∶ 1的流分，前者水洗后離心析出的白色粉末狀為含2個成分的混合物，后者進一步過硅膠柱，細分二元洗脫劑流分，獲得白色晶狀單體。這2個成分的混合物和單體在濃度為20 μg/mL時，抗菌率分別為81.24%、84.16%。經(jīng)鑒定，該單體無患子皂苷結(jié)構(gòu)為常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。該皂苷成分為無患子抗稻瘟病菌活性先導(dǎo)物之一。

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