基于線粒體COⅠ基因序列分析5個巨魾群體的遺傳多樣性

牛寶珍 李娜 劉艷紅 王興龍 陳春麗 文天仙 周亞 杜民

摘要：采集云南省5個不同地域的巨：紅河曼耗（M）、怒江下游（N）、怒江壩（B）、瀾滄江上游（L）、景洪（J）各12尾巨共計60個樣本進行CO Ⅰ基因克隆測序。結果表明，5個巨群體的T、C、A、G 4種堿基平均含量如下：怒江壩（B）群體T、C、A、G堿基含量分別為274%、27.6%、28.0%、17.0%，景洪（J）群體T、C、A、G堿基含量分別為274%、27.6%、28.0%、17.0%，瀾滄江上游（L）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.4%、27.6%、28.0%、17.0%，紅河曼耗（M）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.3%、27.6%、28.1%、17.0%，怒江下游（N）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.3%、27.6%、28.2%、16.9%;5個巨群體的A+T含量均大于C+G含量。用MEGA 5.0軟件構建5個群體系統(tǒng)進化樹顯示景洪和紅河曼耗聚為一支，瀾滄江上游大多數(shù)個體單獨聚為一支，怒江壩和怒江下游群體混合聚為一支;曼耗和景洪的群體間遺傳距離（9.096）最大，本研究結果可為巨的資源保護提供依據(jù)。

關鍵詞：云南省;巨;CO Ⅰ基因;遺傳多樣性

中圖分類號： S917.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0056-03

巨（Bagarius yarrelli）分布于中國云南的怒江、瀾滄江和元江水系，隸屬于硬骨魚綱（Osterichthyes）、鲇形目（Siluriformes）、科（Sisordae）、屬（Bagarius）[1]。巨是產(chǎn)地的主要食用魚類[2]。目前，對于巨魚的研究主要包括巨的生物學特性[2]和野生巨的生物學特性[3]、食性[4]、人工繁殖與胚胎發(fā)育[5]和巨細胞色素氧化酶基因多態(tài)性及系統(tǒng)進化的研究[6]、巨野生群體遺傳多樣性的RAPD分析[7]、巨線粒體DNA ND6基因克隆及多態(tài)性分析[8]、巨魚線粒體12S rRNA和16S rRNA基因克隆及多態(tài)性分析[9]。

隨著分子生物學技術的不斷進步，目前各種分子標記已被廣泛應用于各種生物的分子系統(tǒng)分類和物種鑒定研究，其中線粒體CO Ⅰ基因序列是最常用的分子標記之一[10]。Hebert等提出了利用線粒體細胞CO Ⅰ基因的部分序列建立全球動物的DNA條碼（DNA barcode）標準數(shù)據(jù)庫，從而進行物種簡單有效的識別和鑒定工作[11]。區(qū)別于傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法，DNA條形碼技術更加簡單有效且不受人為和客觀因素的影響，因為DNA條形碼技術是直接用堿基順序來反映物種的客觀指標，對于不同地域魚類的遺傳和進化關系的鑒定更為簡單有效[12]。單云晶等利用線粒體CO Ⅰ基因序列對5個不同的鯉養(yǎng)殖品進行遺傳多樣性分析[13];曹艷等基于線粒體CO Ⅰ基因序列對分布于渤海、黃海、東海和南海海域的6個群體藍點馬鮫遺傳多樣性進行了比較[14];線粒體CO Ⅰ基因序列對于鳥類的系統(tǒng)分類也有很好的依據(jù)性，李濤等對雀科13屬36種鳥類的CO Ⅰ基因部分序列初步分析了雀科鳥類之間的系統(tǒng)發(fā)育關系[15];這些研究都表明線粒體CO Ⅰ基因序列對于物種的分類以及不同地理位置的同一物種的進化關系都是簡單且有效的手段。由于現(xiàn)代工業(yè)化的加快，缺乏物種的保護，巨魚數(shù)量減少，已被列入云南省水生野生動植物保護名錄[16]。為保護巨群體的多樣性，對不同巨群體在分子水平上進行遺傳多樣性研究，為今后建立基于DNA分子標記的巨物種提供資料基礎。本試驗選用來自瀾滄江上游（L）、怒江壩（B）、紅河曼耗（M）、景洪（J）以及怒江下游（N）不同群體的巨作為試驗材料，采用基因克隆方法獲得線粒體CO Ⅰ基因全序列進行分析，構建系統(tǒng)進化樹，探討不同巨群體的遺傳和進化關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用2013年10月至2017年6月采自中國云南臨滄市瀾滄江上游（L）、西雙版納傣族自治州景洪市（J）、紅河曼耗江段（M）、怒江傈僳族自治州怒江壩大橋（B）以及怒江傈僳族自治州三江口怒江下游（N）的巨各12尾，依次編號為 1～12，取其背部肌肉組織放入1.5 mL EP管中并浸入無水乙醇，做好標記置于冰箱-20 ℃保存。

1.2 試驗方法

采用酚-氯仿方法[13]提取巨基因組DNA，1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進行拍照并保存在 -20 ℃ 冰箱。巨PCR擴增所用的引物為杜民等[17]設計合成的1對簡并引物，其名稱和序列分別為Baya09F：5′-GAGTGAAAAYCTCCTAGTCYCT-3′，Baya09F：5′-GTTTCTCATTTAATWGAKCCTCC-3′，經(jīng)過瓊脂糖凝膠檢測的目的PCR產(chǎn)物利用凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收、純化、連接轉(zhuǎn)化后，利用通用M13引物進行菌液PCR后將篩選后的陽性克隆樣品送至上海生物工程有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序結果利用DNAMAN 5.2.2軟件進行比對，采用DnaSP 5.10.01軟件分析核苷酸序列，采用MEGA 5.0軟件對序列的堿基含量、轉(zhuǎn)換和顛換比分析并構建系統(tǒng)進化樹。

2 試驗結果

對測序的結果用DNAMAN 5.2.2軟件對60個巨的核苷酸序列進行比對并用DNAsp[18]軟件比對后發(fā)現(xiàn)在5個群體60個樣本序列共存在59個單倍型，其中怒江下游12個序列存在11個單倍型，其余4個群體的12個序列均發(fā)現(xiàn)12個單倍型;利用MEGA 5.0[19]軟件中的Kimura雙參數(shù)模型[20]分析5個巨群體之間的堿基轉(zhuǎn)換/顛換（R）的范圍在 0.691～31.798，5個群體之間堿基的平均轉(zhuǎn)換/顛換比值范圍為 2.864～9.096。60個體CO Ⅰ基因序列的全長為 1 551 bp，保守位點1 144個、變異位點428個、簡約信息位點267個、單態(tài)突變位點160個。5個巨群體堿基組成百分比結果見表1。

利用MEGA 5.0軟件中Kimura 2-parameter model參數(shù)對本研究5個群體60個巨CO Ⅰ基因核苷酸序列分別進行群體內(nèi)和群體間的遺傳距離分析，群體間平均遺傳距離見表2，右上角為轉(zhuǎn)換+顛換（Ts+Tv），群體間平均遺傳距離左下角為轉(zhuǎn)換/顛換（Ts/Tv）。

本研究選擇斑馬魚（Danio rerio）作為外群，NCBI上面的登錄號為NC_002333。 利用5個群體60尾巨和斑馬魚基于Kimura雙參數(shù)模型建立的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）系統(tǒng)進化樹見圖1。

3 討論

3.1 巨CO Ⅰ基因堿基組成

線粒體基因?qū)倌赶颠z傳且穩(wěn)定，線粒體CO Ⅰ基因既有足夠的變異，又便于PCR擴增，使其成為DNA條形碼基因之一[21-22]，利用其核苷酸序列的差異，可以進行物種鑒別、遺傳及進化關系分析，被廣泛應用于鳥類、魚類、昆蟲和動物的鑒別[23]。本研究采用基因克隆測序方法比較了云南省內(nèi)3個河流5個不同群體（M-紅河曼耗、N-怒江下游、B-怒江壩、L-瀾滄江上游、J-景洪），各12尾巨共計60個樣本的線粒體CO Ⅰ基因全長序列的堿基組成和單倍型進行分析。結果表明，巨線粒體CO Ⅰ基因核苷酸序列長度為 1 551 bp，其保守位點1 144個、變異位點428個、簡約信息位點267個、單一突變位點160個。5個群體巨A+T的含量（55.5%）明顯高于C+G的含量（44.5%），G含量（17.0%）最低，這與單云晶等的研究結果[14]一致。從原核生物到真核生物，其CO Ⅰ基因組中堿基A+T高的現(xiàn)象廣泛存在，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生與基因長度以及密碼子反密碼子間結合能力的大小有關[24]。

3.2 基于CO Ⅰ基因的不同巨群體的親緣關系

5個群體中每12個個體中得到的單倍型除了怒江下游（N）群體為11個單倍型外，其余4個群體各得到12個單倍型，60個個體共得到59個單倍型，這可能是由于本試驗利用的是CO Ⅰ基因的全長序列而不是特定的條形碼所需的部分序列（648 bp）[22];5個群體的單倍型不存在共享的情況，表明5個巨魚群體的遺傳多樣性較高。不同群體的單倍型個體在系統(tǒng)進化樹上交織在一起，其中怒江壩（B）群體和怒江下游（N）交叉最為嚴重，這一結果與董新培等在日本沼蝦群體中的研究結果[25]相一致。紅河曼耗（M）群體和景洪（J）群體和另外其他3個不存在交叉情況，且紅河曼耗（M）群體和景洪（J）群體的遺傳距離較小。5個群體中怒江壩（B）群體和怒江下游（N）群體聚為一支、紅河曼耗（M）和景洪（J）聚為一支;瀾滄江上游（L）單獨為一支并且靠近怒江壩（B）和怒江下游（N）的分支，這可能與其不同流域的基因交流有關系。巨是分布在東南亞的越南、柬埔寨、緬甸、印度及中國云南的元江（紅河）、瀾滄江和怒江的底棲性魚類，由于味道鮮美而受到當?shù)鼐用竦南矏?，本研究中的?個群體來自紅河的曼耗段（M），而紅河最終經(jīng)過中國的河口流向越南后最終到達北部灣，2個群體來自瀾滄江的瀾滄縣段（L，瀾滄江上游）和景洪段（J），而最終經(jīng)過緬甸、老撾、泰國、柬埔寨、越南后進入南海，2個群體來自怒江的潞江壩段（B）和三江口段（N，怒江下游），怒江經(jīng)由緬甸后流入印度洋;這樣的地理狀況為巨群體間的基因交流提供了可能性。怒江壩、景洪、瀾滄江上游、曼耗、怒江下游同一群體內(nèi)的遺傳距離分別為4.629、4.000、2.697、3.427、6.718，以怒江下游群體內(nèi)的遺傳距離最大。遺傳距離越大表明該群體內(nèi)的遺傳多樣性越豐

富，本研究中怒江下游群體的遺傳多樣性最豐富、怒江壩群體次之、瀾滄江上游群體的遺傳多樣性最小。遺傳多樣性的豐富程度表明了這個生物群體對于外界環(huán)境的適應能力，本研究的結果可為巨的遺傳資源保護提供分子方面的依據(jù)。

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