江蘇省畜禽飼料中轉(zhuǎn)基因成分的檢測分析

邢宇俊 陸丹丹 吳季榮 王園園 徐劍宏 史建榮

摘要：隨著轉(zhuǎn)基因植物研究的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的應(yīng)用也更加廣泛。在我國，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的來源主要是進口，主要是玉米、大豆，主要用于飼料加工行業(yè)。為了調(diào)查轉(zhuǎn)基因玉米、大豆在江蘇省畜禽飼料市場的分布情況，在江蘇省市場抽取40份雞、鵝和豬飼料以及飼料原料，通過定性PCR檢測玉米內(nèi)標zSSIIb、大豆內(nèi)標Lectin、花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、NOS終止子、Bt、EPSPS基因，同時檢測玉米、大豆轉(zhuǎn)化體事件MON810、MON89788、GTS40-3-2和MON87701。結(jié)果表明，90%的飼料都含有轉(zhuǎn)基因成分;轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體事件MON810占50%，轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體MON89788、GTS40-3-2、MON87701的檢出率都為80%。由研究結(jié)果可知，江蘇省市場的雞、鵝和豬飼料及飼料原料中轉(zhuǎn)基因成分的占有率較高，需要進一步加強對飼料原料的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管。

關(guān)鍵詞：畜禽飼料;轉(zhuǎn)基因作物;轉(zhuǎn)基因成分檢測

中圖分類號： S816.17? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0052-04

轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organisms，簡稱GMOs）是指借助于基因工程技術(shù)將其他來源的基因轉(zhuǎn)移到植物、動物或微生物的基因組中，使其性狀發(fā)生改變，如提高抗蟲性、營養(yǎng)成分含量或提升耐除草劑性狀等，以期達到延長保質(zhì)期等目的[1-2]。

自從首例轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品被批準商業(yè)化生產(chǎn)以來，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物在不同國家和地區(qū)開始被商業(yè)化種植，截至2016年，全球種植轉(zhuǎn)基因作物的面積已達到1.85億hm2。其中種植面積排名前4位是大豆、玉米、棉花、油菜，分別占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%、33%，12%、5%[3]。在我國允許進口的46種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中，轉(zhuǎn)基因大豆、玉米的品種最多，它們主要被用于飼料加工業(yè)中[4-5]。

我國對于飼料糧的需求缺口非常大，在全球糧食危機的背景下，我們不能單純地使用非轉(zhuǎn)基因糧食作為飼料加工原料，而應(yīng)將非轉(zhuǎn)基因作物用于滿足飼料工業(yè)。由于江蘇省的畜禽養(yǎng)殖業(yè)比較發(fā)達，對飼料原料的需求量較大，因此，可以帶來高附加值的轉(zhuǎn)基因作物成為飼料生產(chǎn)的首要選擇。

對大豆、玉米開展轉(zhuǎn)基因檢測，通常檢測的外源基因包括大多數(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中使用的花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、胭脂堿合成酶NOS終止子、抗蟲Bt基因和除草劑EPSPS基因。由于這些序列在大多數(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中存在一種或多種，因此本研究擬選用常規(guī)的核酸檢測技術(shù)PCR方法進行分析[4，6]，同時對陽性樣品進行轉(zhuǎn)化體品系的確定。通過對江蘇省飼料中轉(zhuǎn)基因成分的篩查，可為政府部門對飼料業(yè)的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管提供數(shù)據(jù)，也可為江蘇省轉(zhuǎn)基因行業(yè)的監(jiān)管提供支撐。

1 材料與方法

1.1 飼料樣品

共選取40份飼料，分別由多家公司生產(chǎn)，具體飼料信息見表1。其中包括乳豬濃縮飼料、母豬濃縮飼料、草雞配合飼料、種雞配合飼料、鵝飼料等，以及用作飼料原料的麥麩、玉米和豆粕。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、DNA marker、dNTPs，購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他試劑為實驗室常規(guī)分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物 根據(jù)農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）頒布的標準條例，對飼料樣品中含有的內(nèi)參基因Lectin和zSSIIb，外源基因花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、NOS終止子、EPSPS基因、Bt基因以及GTS40-3-2、MON89788、MON87701、MON810轉(zhuǎn)化體特異性序列進行檢測。引物序列相關(guān)信息見表2。

1.3.2 飼料DNA的提取 稱取10 g飼料樣品（顆粒性的），在攪拌器中磨碎（顆粒大小應(yīng)小于2 mm。用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA[14]。

1.3.3 PCR檢測分析 PCR體系：2.5 μL 10×PCR buffer，2.5 μL Mg2+，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，0.25 μL Taq DNA聚合酶，加水補至25 μL。

Lectin、zSSIIb、 CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt、GTS40-3-2、MON89788、MON810、MON87701基因片段的PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃，7 min。EPSPS基因的PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 7 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5個循環(huán);94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖檢測，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察基因擴增片段的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中DNA的質(zhì)量分析

對提取的飼料DNA進行質(zhì)量和濃度的測定，用核酸蛋白濃度檢測儀測定所有樣品溶液的濃度，并稀釋至40 ng/μL后使用，純度（D260 nm/280 nm）均在1.7～2.0間，表明提取的DNA濃度和純度較好，可用于下一步試驗。

2.2 定性PCR結(jié)果分析

2.2.1 飼料中內(nèi)參基因的分析 當前飼料的主要來源是玉米和豆粕，通過對飼料中內(nèi)參基因的分析可以判斷飼料的組成部分。通過對40種飼料樣品的內(nèi)參基因Lectin和zSSIIb進行分析發(fā)現(xiàn)，混合飼料主要來源于玉米、大豆（本試驗也對水稻SPS、油菜HMGI/Y內(nèi)參基因進行擴增，沒有擴增出相應(yīng)片斷）;從豆粕、玉米飼料中分別擴增出對應(yīng)的內(nèi)參基因;從麥麩中檢測出大豆內(nèi)參基因（圖1）。

2.2.2 飼料中外源基因的篩查 對玉米和大豆及其加工品中的外源基因進行檢測，通過對其所有轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的轉(zhuǎn)基因玉米和大豆中含有CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt、EPSPS中的1種或幾種基因，因此對40份飼料樣品中外源基因的篩查選用CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt、EPSPS基因進行。圖2結(jié)果顯示，在混合飼料中，36份含有CaMV35S啟動子，占總飼料的90%;32份飼料含有NOS終止子，占總飼料的80%;32份飼料含有Bt基因，占總飼料的80%;32份飼料含有EPSPS基因，占總飼料的80%。由此可見，飼料中轉(zhuǎn)基因成分的占比較高。

2.2.3 飼料中所含轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的驗證 根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）批準進口的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體品種以及對其外源基因的分析，對其中的轉(zhuǎn)化體品系（轉(zhuǎn)基因玉米MON810與轉(zhuǎn)基因大豆MON89788、GTS40-3-2、MON87701）進行轉(zhuǎn)化體特異性序列擴增比對。由圖3可以看出，有20份飼料中含有轉(zhuǎn)基因玉米MON810，占總飼料的50%;32份飼料中都含有轉(zhuǎn)基因大豆MON98788、GTS40-3-2、MON87701，占總飼料的80%。

2.3 40份飼料中轉(zhuǎn)基因成分的分布

由圖4對每份樣品的分析結(jié)果可以看出，擴增檢測出大豆Lectin、玉米zSSIIb內(nèi)參基因的飼料樣品，都含有1種或多種外源基因成分;共檢測到36份含有轉(zhuǎn)基因成分的飼料，占總數(shù)的90%（36/40）;而沒有檢測出大豆Lectin、玉米zSSIIb內(nèi)參基因也沒有檢測到其體他外源基因成分的樣品占10%。CaMV35S啟動子的檢出率為90%（36/40）;NOS終止子的檢出率為80%（32/40）;Bt基因的檢出率為80%（32/40）;EPSPS基因的檢出率為80%（32/40）;轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體事件MON810的檢出率為50%（20/40）;轉(zhuǎn)基因大豆MON89788、MON87701、GTS40-3-2的檢出率都為80%（32/40）?？梢?0份飼料樣品中轉(zhuǎn)基因飼料的比例較高。

3 討論

當前種植面積比較大的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物是玉米、大豆，在我國國內(nèi)，轉(zhuǎn)基因玉米、大豆的很多轉(zhuǎn)化體已經(jīng)被批準進口用于飼料加工。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，用于飼料中的麥麩沒有檢測出任何轉(zhuǎn)基因成分，這是因為轉(zhuǎn)基因小麥商業(yè)化生產(chǎn)的比較少，并且國內(nèi)也不允許轉(zhuǎn)基因小麥進口;另外，24號5%乳豬復(fù)合預(yù)混料和28號5%產(chǎn)蛋期復(fù)合預(yù)混料中也不含有任何轉(zhuǎn)基因成分。此外，36份飼料和飼料原料中都含有轉(zhuǎn)基因成分，占比達到90%，可見江蘇省畜禽飼料中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的占有率比較高，江蘇省飼料中轉(zhuǎn)基因成分的含量同山西省的情況比較接近，山西省達到了100%[15]，這也說明我國飼料業(yè)中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的占有率很高，檢測出的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體事件是我國批準進口的轉(zhuǎn)基因材料，允許用于飼料加工業(yè)。

在本試驗中發(fā)現(xiàn)，用于飼料原料的玉米顆粒是轉(zhuǎn)基因玉米MON810。而國內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的監(jiān)管主要集中在大田作物、種子行業(yè)、食品行業(yè)等領(lǐng)域，對飼料原材料中轉(zhuǎn)基因材料的監(jiān)管力度比較小，而江蘇省內(nèi)飼料中使用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品作為原材料的飼料比例較高，應(yīng)該加強對轉(zhuǎn)基因原材料的跟蹤和監(jiān)管，以免原材料散落于大田中造成污染，從而保證轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的合理、合法使用。

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