水稻花粉育性相關(guān)基因研究進(jìn)展

馬龍 徐薇 竇玲玲 柯笑楠 劉明月 耿艷飛 黃霞 賈玉芳 劉慶坡

摘要：花粉發(fā)育為水稻生殖發(fā)育不可或缺的過程之一，其育性高低對水稻育種以及經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重要意義。大量研究發(fā)現(xiàn)，水稻花粉發(fā)育是嚴(yán)格受基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)過程。基于此，本文綜述與水稻花粉育性相關(guān)的蛋白編碼基因和調(diào)控性miRNA的研究現(xiàn)狀，總結(jié)有關(guān)基因在調(diào)控水稻花粉育性方面的生物學(xué)功能及作用機(jī)制，并對該領(lǐng)域未來的發(fā)展趨勢作出分析與展望，從而為水稻分子設(shè)計育種提供理論參考。

關(guān)鍵詞：水稻;花粉發(fā)育;生殖發(fā)育;相關(guān)基因;miRNA;育種利用

中圖分類號： S511.03? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0042-05

水稻是世界性主要糧食作物之一，為全球50%以上人口提供食物，同時也是重要的單子葉模式植物之一[1]，因此對水稻的不斷深入研究具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。隨著人口數(shù)量的不斷增長、生態(tài)環(huán)境的惡化、耕地面積的持續(xù)減少以及人們對食品安全的重視，在可預(yù)見的將來，糧食短缺及由此引發(fā)的其他問題將日益突顯。因此，培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的水稻新品種顯得尤為重要，這要求研究者在了解水稻宏觀表型變化的基礎(chǔ)上更深入理解其分子調(diào)控機(jī)制等?；蚪M學(xué)育種及分子育種能夠高效地對植物生理學(xué)、遺傳學(xué)、生物技術(shù)及基因表達(dá)調(diào)控等研究進(jìn)行有機(jī)整合，因此已成為解決當(dāng)前問題的有效途徑。鑒于基因組學(xué)育種主要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)等充分挖掘并利用有利基因[2]，近幾十年來大量調(diào)控不同農(nóng)藝性狀的相關(guān)基因被相繼鑒定和克隆[3-4]。

水稻單產(chǎn)是受內(nèi)在遺傳和外部環(huán)境影響的綜合性狀，與植株器官形態(tài)構(gòu)建、光合效率、礦質(zhì)元素的高效利用以及授粉和授精過程、抗逆性等密切相關(guān)[5]。穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和粒質(zhì)量等是構(gòu)成水稻稻谷產(chǎn)量的主要因素[6]，其中穗數(shù)、穗粒數(shù)[7]、粒質(zhì)量[8-10]和株型等水稻產(chǎn)量性狀已被深入研究，且研究者已鑒定并克隆了許多相應(yīng)的基因[11-12];而對水稻產(chǎn)量同樣具有決定作用的結(jié)實(shí)率相關(guān)功能基因鑒定及調(diào)控水稻單產(chǎn)形成內(nèi)在機(jī)制等方面的研究，進(jìn)展相對比較緩慢[13]。迄今，已克隆到幾個調(diào)控水稻結(jié)實(shí)率的重要基因，且其中多數(shù)基因參與了水稻花粉的發(fā)育進(jìn)程[6，13-16]。例如通過促進(jìn)花粉管生長正向調(diào)節(jié)水稻結(jié)實(shí)率的PTB1基因[13]以及通過促進(jìn)花粉管伸長和調(diào)控胞內(nèi)鈣離子平衡提高水稻穗籽粒結(jié)實(shí)率的OsCNGC13基因[16]等。盡管如此，對于通過調(diào)控水稻花粉發(fā)育進(jìn)而影響結(jié)實(shí)率的內(nèi)在機(jī)制認(rèn)識仍十分有限。此外，雄性不育的發(fā)現(xiàn)和利用為主要農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢利用提供了保障，其中雜交水稻的培育為世界糧食生產(chǎn)發(fā)揮了舉足輕重的作用[17]。然而，雜交后代的結(jié)實(shí)率往往低于親本，且已成為利用雜種優(yōu)勢進(jìn)行水稻產(chǎn)量性狀改良的一個主要瓶頸[13]，因此對結(jié)實(shí)率相關(guān)基因的研究已成為水稻育種工作的主要熱點(diǎn)之一，其中花粉育性作為結(jié)實(shí)率的決定因素之一，其相關(guān)研究備受關(guān)注。

在高等植物中，花粉發(fā)育是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程。在一系列相關(guān)基因的協(xié)同作用下，小孢子母細(xì)胞在花粉囊中進(jìn)行減數(shù)分裂產(chǎn)生小孢子，并進(jìn)一步發(fā)育成花粉粒;當(dāng)花粉囊裂開時，成熟的花粉粒被釋放出來[18]。馮九煥等以秈稻品種IR36為材料，對水稻花粉發(fā)育過程及其藥壁組織進(jìn)行了系統(tǒng)觀察，詳細(xì)地描繪了其超微結(jié)構(gòu)特征，并依據(jù)不同時期特點(diǎn)將水稻花粉發(fā)育過程劃分為8個時期[19-20]。Itoh等也將該過程分成8個時期，其中前4個時期是花藥孢子體發(fā)育時期，后4個時期是花粉發(fā)育時期[1，21]。在此基礎(chǔ)上，后來的研究者進(jìn)一步將水稻花藥發(fā)育過程由原來的8時期細(xì)分為14時期[22-23]，這些時期不同生物過程的循序漸進(jìn)最終保證了花粉的完整發(fā)育。目前，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等研究最深入的主要涉及水稻絨氈層和花粉壁等發(fā)育過程?；诖?，本文主要綜述當(dāng)前與水稻花粉育性相關(guān)蛋白編碼基因和miRNA的研究進(jìn)展并初步闡釋其在水稻花粉育性調(diào)控中的作用及機(jī)制，以期加深相關(guān)研究人員和育種工作者對花粉育性相關(guān)基因及生物學(xué)功能、調(diào)控途徑等方面的認(rèn)識，從而為相關(guān)基因的進(jìn)一步育種利用等提供參考。

1 水稻花粉育性相關(guān)蛋白編碼基因

水稻的成熟花粉是由2或3個細(xì)胞組成的雄配子體，廣義的花粉概念則包括從小孢子到成熟花粉的各個階段[24]，每個階段都是在特定基因協(xié)作下完成的。任何參與花粉形成過程的基因發(fā)生突變，均可導(dǎo)致花藥花粉異常，最終導(dǎo)致雄性不育[25]。近年來，隨著研究的不斷深入，研究者已陸續(xù)鑒定并克隆了多個與水稻花粉敗育及花粉缺失等相關(guān)的功能基因（表1）。

1.1 花粉敗育相關(guān)基因

花粉敗育是指受內(nèi)外環(huán)境因素影響導(dǎo)致花粉不能正常發(fā)育起到生殖作用的現(xiàn)象，其主要原因是花粉母細(xì)胞不能正常減數(shù)分裂以及絨氈層細(xì)胞作用失常。絨氈層細(xì)胞是花藥發(fā)育過程中短暫存在的并位于花藥最內(nèi)層的細(xì)胞，它直接包裹著小孢子母細(xì)胞及分化后的小孢子[48]。絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中富含線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，代謝非常旺盛[49]。研究發(fā)現(xiàn)，絨氈層細(xì)胞的降解是一個細(xì)胞程序性死亡的過程，在此過程中會釋放大量在絨氈層細(xì)胞內(nèi)合成的物質(zhì)，用于小孢子及其外壁的發(fā)育[40，50]。因而，絨氈層和花粉的發(fā)育是受一系列基因調(diào)控的復(fù)雜生理進(jìn)程，時序上嚴(yán)格匹配。

1.1.1 絨氈層發(fā)育和PCD相關(guān)調(diào)控基因 目前，研究者利用突變體克隆了一些絨氈層發(fā)育相關(guān)基因，包括Udt1和TDR等。UDT1為bHLH轉(zhuǎn)錄因子，主要作用于細(xì)胞減數(shù)分裂早期，其T-DNA或Tos17插入突變體表現(xiàn)為雄性不育[37]。突變體udt1的絨氈層不能分化和液泡化，并且性母細(xì)胞不能分化成小孢子，中間層細(xì)胞不退化，因而花粉囊內(nèi)不能產(chǎn)生正?；ǚ踇51]。TDR也是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。在水稻花藥發(fā)育過程中，TDR通過觸發(fā)絨氈層PCD而調(diào)控花粉壁發(fā)育[40]。突變體tdr的絨氈層和中層降解延遲，花粉粒皺縮，且TDR可直接與2個下游基因OsCP1和OsC6互作[40]，其中OsCP1編碼一個半胱氨酸蛋白酶，在花藥發(fā)育中發(fā)揮重要作用[51];OsC6是一個脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因，在水稻未成熟花藥的絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)[43]，該基因可通過抑制水稻烏氏體和花粉外壁發(fā)育而使其發(fā)生缺陷，并且降低花粉育性。Zhang等發(fā)現(xiàn)，TDR突變后還可導(dǎo)致花藥表皮蠟質(zhì)和花粉壁的形成異常[52-53]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TDR能結(jié)合OsADF基因啟動子的E-box基序并調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而通過參與ADF（花藥發(fā)育相關(guān)的F-box蛋白）介導(dǎo)的蛋白水解途徑調(diào)節(jié)絨氈層細(xì)胞的發(fā)育和花粉形成[54]。

水稻花藥絨氈層細(xì)胞的程序性死亡是受一系列基因嚴(yán)格調(diào)控的過程。除正向調(diào)控因子TDR等外，Niu等克隆了1個在絨氈層細(xì)胞特異表達(dá)的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子EAT1基因，該基因的突變體eat1表現(xiàn)為絨氈層降解延遲，不能形成正常的花粉粒，導(dǎo)致花藥干癟;深入研究發(fā)現(xiàn)，EAT1作用于TDR的下游，可通過直接調(diào)控天冬氨酸蛋白酶基因OsAP25和OsAP37的表達(dá)，促進(jìn)植物絨氈層細(xì)胞的程序性死亡[39]。Yi等利用 T-DNA插入突變體鑒定到一個調(diào)控絨氈層PCD的基因DTC1，其突變體dtc1表現(xiàn)為雄性不育，花藥發(fā)育缺陷，絨氈層增大不退化，中層降解延遲;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DTC1可通過抑制OsMT2b的活性氧清除活性，調(diào)控絨氈層的PCD進(jìn)程[38]。

1.1.2 花粉壁發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因 花粉壁是花粉不可缺少的重要部分，也是花粉育性重要的決定因子之一。Ueda等從水稻Tos17插入突變體庫中鑒定到一個花粉敗育的突變體cap1，該突變體的雜合體有1/2的花粉粒發(fā)生干癟畸變，且畸形花粉粒內(nèi)所有的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充物、細(xì)胞核和內(nèi)孢細(xì)胞壁幾乎全部缺失，因而不能萌發(fā);利用原位雜交等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CAP1主要在發(fā)育的花粉粒、絨氈層和藥室內(nèi)壁中表達(dá);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該突變體花粉粒畸變主要是由L-阿拉伯糖（L-arabinose）毒性積累所致或由UDP-L-arabinose（源于 L- 阿拉伯糖1-磷酸鹽轉(zhuǎn)變）缺乏而抑制細(xì)胞壁代謝造成[29]。此外，Moon等鑒定到一個主要在成熟花粉粒中表達(dá)的編碼糖基化轉(zhuǎn)移酶的基因OsGT1，其T-DNA插入突變體osgt1的花粉在減數(shù)分裂階段正常但在成熟期活力丟失;進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，該突變體的花粉內(nèi)壁結(jié)構(gòu)遭到破壞，且其淀粉、蛋白含量顯著下降[42]。因此，花粉壁發(fā)育缺陷將導(dǎo)致水稻花粉育性降低。

1.1.3 其他基因 除了絨氈層和花粉壁發(fā)育相關(guān)基因外，人們利用花粉突變體還克隆到一些其他調(diào)控基因，比如rip1和Osabcg15。rip1是Han等從水稻T-DNA插入突變體庫中篩選到的一個花粉特異突變體，其花粉中線粒體、高爾基體、脂肪體、質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)育都表現(xiàn)為延遲;在體外培養(yǎng)條件下，該突變體的花粉不能萌發(fā)，而野生型對照的花粉萌發(fā)率>90%，表明RIP1基因是水稻花粉發(fā)育晚期的調(diào)節(jié)因子，是花粉成熟和萌發(fā)所必需的[26]。另外，Wu等利用秈稻恢復(fù)系縉恢一號獲得一個不能產(chǎn)生有活力花粉的突變體Osabcg15，該突變體的花藥短窄且白化，花藥表皮異常、中層增大、烏氏體發(fā)育異常、絨氈層不完全退化、沒有外壁，花粉粒收縮[32]。Niu等深入分析發(fā)現(xiàn)，OsABCG15可能在孢子花粉素合成或孢子花粉素從絨氈層細(xì)胞向花藥室轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[33]。

1.2 花粉缺失相關(guān)基因

除花粉敗育外，花粉缺失是另一個影響水稻正常生殖發(fā)育的主要因素。Jung等曾鑒定到一個蠟質(zhì)缺陷的花藥突變體Wda1，該突變體所有細(xì)胞壁層的超長鏈脂肪酸合成受阻，花藥外層的角質(zhì)臘層缺失，小孢子的發(fā)育嚴(yán)重遲緩，導(dǎo)致花粉外壁的形成發(fā)生缺陷，最終造成花粉缺失[27]。同樣地，Jiang等鑒定到一個無花粉突變體基因Osnop，該基因只在花粉發(fā)育和花粉管萌發(fā)時表達(dá)，因而控制水稻雄配子的發(fā)育[30]，但是它在水稻花粉成熟時的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

此外，研究者還克隆了許多其他造成花粉缺失的相關(guān)基因。例如絨氈層PCD的必需調(diào)控因子基因OsTDF1[55]、絨氈層決定基因OsTDL1A[56]、控制水稻花器官尤其花粉發(fā)育及水稻籽粒糊粉層α淀粉酶活性的基因OsGAMYB[44]、調(diào)控水稻孢子花粉素合成并參與誘導(dǎo)絨氈層降解的?；o酶A合成酶基因OsACOS12[57-58]以及影響花粉發(fā)育過程中淀粉合成，進(jìn)而影響花粉缺失的基因OsPGM[59]等，這些基因的發(fā)現(xiàn)與功能研究加深了人們對水稻花粉發(fā)育分子機(jī)制的了解。

2 水稻miRNA與花粉育性

miRNA是一類長20～24個核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因互補(bǔ)結(jié)合來介導(dǎo)mRNA的降解或在翻譯水平上抑制其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)性等[45]。例如，miRNA可參與調(diào)控水稻根系的生長發(fā)育[46]、水稻營養(yǎng)生長與生殖生長轉(zhuǎn)換[47]以及水稻衰老期葉片發(fā)育[60]等不同生物學(xué)過程。

近年來，隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，在不同物種中鑒定到越來越多的具有不同調(diào)控功能的miRNA。截至目前，在miRBase數(shù)據(jù)庫中已注冊有來自223個不同物種的28 645個前體miRNA（pre-miRNA），共表達(dá)35 828個成熟序列，其中從水稻基因組中鑒定到592個前體miRNA和713個成熟miRNA（http：//www.mirbase.org，release 21）[61]。大量研究發(fā)現(xiàn)，同一miRNA在植物不同生長發(fā)育時期具有不同的表達(dá)模式，且在同一時期表達(dá)的miRNA也具有明顯的多樣性;miRNA與其作用靶基因組成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)過程，進(jìn)而在植物生命周期中發(fā)揮重要作用[62-64]。

花粉發(fā)育是開花植物生命周期中最重要的時期之一。近年來，隨著高通量測序等技術(shù)的應(yīng)用，有關(guān)miRNA參與調(diào)控水稻花粉發(fā)育的研究不斷展開并取得一定進(jìn)展。Wei等系統(tǒng)探究了水稻花粉發(fā)育過程中miRNA的表達(dá)情況，共鑒定到292個已知miRNA和75個新miRNA，其中202個已知miRNA在花粉發(fā)育過程有所表達(dá)，且其中103個的表達(dá)明顯富集，而新鑒定的75個miRNA中半數(shù)以上在花粉發(fā)育中呈現(xiàn)出組織特異性或者在發(fā)育時期特異表達(dá)[65]。在比較同源四倍體和二倍體水稻花粉發(fā)育過程中miRNA的表達(dá)譜時，Li等發(fā)現(xiàn)，相對于二倍體，四倍體水稻有321個差異表達(dá)的miRNA，且同源四倍體水稻花粉和胚囊中miRNA的表達(dá)譜也截然不同，每個miRNA平均有3個與花粉發(fā)育有關(guān)的作用靶基因[66];此外，與轉(zhuǎn)座因子相關(guān)的siRNA在四倍體水稻胚囊中上調(diào)表達(dá)，而在花粉發(fā)育過程中發(fā)生下調(diào)[67]。由此可見，miRNA可能確實(shí)參與了水稻花粉發(fā)育的生物學(xué)調(diào)控過程，但其與靶基因互作進(jìn)而調(diào)控水稻花粉育性的內(nèi)在分子機(jī)制等仍需進(jìn)一步深入闡明。

雜交水稻的育種及大范圍推廣應(yīng)用，對世界糧食供給作出了巨大貢獻(xiàn)，因此對水稻雜交育種的研究始終是育種家的一個重要關(guān)注點(diǎn)。目前以細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（CMS）為基礎(chǔ)的三系雜交和以細(xì)胞核雄性不育系為基礎(chǔ)的兩系雜交是雜交水稻的主要2種育種方式，其中雄性不育系的研究是水稻雜交育種的重點(diǎn)所在。在水稻中，miR156通過作用于靶基因SPL來參與水稻雄配子體的形成過程[68]。以水稻光周期/溫敏性核雄不育系WuxiangS（WXS）為材料，Zhang等研究了其育性轉(zhuǎn)換時期miRNA的表達(dá)模式，共鑒定出497個已知miRNA和273個新miRNA，在可育和不育WXS材料間共發(fā)現(xiàn)26個表達(dá)量存在顯著差異的miRNA，其中11個表達(dá)量下調(diào)，15個表達(dá)量上調(diào);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，水稻miR156a-j和miR164d等調(diào)控的靶基因多與花粉育性相關(guān)，表明miRNA確實(shí)參與了WXS花粉發(fā)育及育性轉(zhuǎn)換進(jìn)程;此外，在水稻不育材料WXS的育性轉(zhuǎn)換期發(fā)現(xiàn)，miR5967與其靶基因（一種鈣離子結(jié)合蛋白基因）互作，通過參與調(diào)控鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在WXS育性轉(zhuǎn)換過程發(fā)揮一定的調(diào)控作用[69]。

盡管近年來，人們已陸續(xù)發(fā)掘到一些與水稻花粉育性相關(guān)的miRNA，但在深入揭示其生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制等方面進(jìn)展十分緩慢。Zhou等發(fā)掘到一個與調(diào)控水稻光溫敏雄性不育有關(guān)的miRNA——P/TMS12-1，在農(nóng)墾58S和培矮64S中超量表達(dá)該miRNA可顯著恢復(fù)其花粉育性;生物信息學(xué)分析顯示，P/TMS12-1擁有10個潛在靶基因[70]，但它到底與哪個（些）靶基因互作進(jìn)而調(diào)控水稻花粉育性尚不清楚?？傊居允且粋€復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，其間參與的基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止目前所發(fā)掘的。因此，要想充分理解水稻花粉育性的分子機(jī)制，仍需要在原有基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)掘新基因，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)等探明其生物學(xué)功能。

3 總結(jié)與展望

水稻花粉發(fā)育是一個連續(xù)的、復(fù)雜的生物學(xué)過程，該過程受一系列基因精細(xì)調(diào)控，涉及此過程的任何基因發(fā)生突變都將影響花粉的正常發(fā)育。近年來，研究者已陸續(xù)克隆了許多相關(guān)基因，并且對其相應(yīng)功能進(jìn)行了研究，其中包括花粉發(fā)育調(diào)控基因Wda1[30]、花粉半不育基因pss1[31，71]、花粉缺失基因Osnop[55]、花粉管堵塞基因PTB1[13]以及絨氈層相關(guān)基因OsTDL1A[56]、絨氈層發(fā)育調(diào)控基因Udt1[72]和TDR[40]等。盡管如此，人們對于花粉發(fā)育分子機(jī)制的認(rèn)識仍很有限。例如，Deveshwar等以水稻花粉發(fā)育的4個不同時期（包括減數(shù)分裂前期、減數(shù)分裂期、單核細(xì)胞期和三核細(xì)胞期）為研對象，利用基因芯片和測序技術(shù)對其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，至少22 000個基因在花粉發(fā)育不同時期有所表達(dá)，其中減數(shù)分裂期最多（18 090個），三核細(xì)胞期最少（15 465個）;此外，通過比較水稻營養(yǎng)生長期和生殖生長期的基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在花粉發(fā)育期特異表達(dá)的基因約有1 000個，但在上述發(fā)現(xiàn)的基因中約1/2的生物學(xué)功能未知[73]。表明對于水稻花粉發(fā)育的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，仍有太多未知領(lǐng)域需進(jìn)一步探索。此外，與水稻花粉發(fā)育相關(guān)miRNA的發(fā)掘及功能研究才起步不久，在花粉發(fā)育過程中miRNA自身的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，其如何與靶基因互作以及如何影響其他miRNA和蛋白編碼基因的表達(dá)等是充分理解花粉育性迫切需要解決的問題。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及基因編輯等技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的miRNA和蛋白編碼基因的生物學(xué)功能將被逐步闡明，這必將為人們充分理解水稻花粉育性的調(diào)控機(jī)制奠定堅實(shí)基礎(chǔ)。

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