UHPLC-Q-TOF MS/MS測定稻米代謝物的方法研究

肖 然，馬 鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090)

0 前言

水稻作為最重要的糧食作物，其代謝物尤其是次級代謝物不僅為植株生長提供能量，也是人類和動物營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源。次級代謝產(chǎn)物主要是指植物細胞代謝和調(diào)控過程的內(nèi)源性小分子終產(chǎn)物。次級代謝物水平是生物系統(tǒng)對環(huán)境變化和遺傳修飾的終端響應(yīng)[1]。植物體中目前鑒定出的次級代謝物有20萬～106萬種，它們在植物的生長發(fā)育、抵御生物脅迫和非生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用[2]。

植物產(chǎn)生的代謝物的種類多樣性和含量差異性遠遠超過微生物乃至動物，因此對這些代謝物分析通常需要高靈敏度、高分辨、高通量的高效分析平臺。核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)是一種高通量且無偏向性的分析手段，適用于少量代謝物的實時動態(tài)檢測和結(jié)構(gòu)鑒定，但NMR檢測范圍小，靈敏度較低，不適用于大范圍植物次級代謝物的檢測。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)是最早應(yīng)用于大規(guī)模植物代謝物分離研究的技術(shù)手段，它具有高靈敏度和高分辨能力，并且檢測出的化合物可利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行檢索和比對。但GC-MS不適合分析熱不穩(wěn)定、不易揮發(fā)、分子量較大及極性較強的代謝物，如糖類、氨基酸等成分，需要衍生化才能得到較多的代謝物組分信息[3]。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)不受待測物揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的影響，適合分離熱不穩(wěn)定、不易揮發(fā)及分子量較大的代謝物，尤其對生物堿、皂苷、酚酸及多胺等植物次生代謝物有較好的分析能力[4]，LC-MS樣品前處理較為簡單、檢測溫度低、物質(zhì)分離快速、高效，與MS高靈敏度、高專屬性的優(yōu)點結(jié)合，具有提純和檢測單一物質(zhì)的能力，是目前是植物次級代謝產(chǎn)物相關(guān)研究中最常用的分析技術(shù)[5]。超高效液相色譜(UHPLC)比HPLC具有更快速、高效、靈敏的特點，與質(zhì)譜聯(lián)用時可減少基質(zhì)干擾效應(yīng)，從而提高質(zhì)譜的檢測靈敏度。近年來UHPLC-MS技術(shù)為植物次級代謝物研究提供了巨大的推動力[6-8]。

本實驗旨在建立一種利用UHPLC-Q-TOF MS/MS方法對大米代謝物的分析方法，以稻米為研究對象，以識別出的特征峰個數(shù)和得到的總峰面積為評價指標，通過單因素實驗分別考察樣品前處理方式(包括提取溶劑，料液比，提取方式以及提取時間)對水稻種子中代謝物的提取效率及液相條件(包括梯度洗脫條件和色譜柱溫)對樣品分離效果的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

KQ-700D型數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)，3K15型高速臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)，MX-S型渦旋儀(大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司)，1290型UHPLC液相色譜系統(tǒng)(德國Agilent公司)，6540 UHD型Q-TOF質(zhì)譜儀(德國Aglient公司)。

乙腈(美國Merck公司)，甲酸(美國Sigma有限責任公司)均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

在樣品制備前，水稻樣本儲存在干燥的冷藏室(-20℃，RH15%)。稻谷先進行脫殼和分離，再挑選出種粒飽滿水稻顆粒，加入液氮進行研磨，并過80目篩，得到均勻的大米粉。樣品儲存于干燥的冷藏室中(-20℃，RH15%)，避免陽光直射直至樣品提取。

1.2.2 樣品提取

稱取600 mg的研磨過的大米粉末置于玻璃試管中，按不同料液比(1∶3，1∶5，1∶10，1∶20)加入三種提取溶液甲醇、乙腈及水(甲醇∶乙腈∶水=1∶0∶0，0∶1∶0，1∶1∶0，1∶0∶1，0∶1∶1，1∶1∶1)。渦旋混合器混勻10 s后，25℃條件下經(jīng)不同提取時間(5 min，15 min，30 min，60 min，90 min)和三種提取方法(震蕩，超聲和渦旋)，提取結(jié)束后渦旋混合器混勻10 s。提取混合物在4℃，8500×g條件下離心20 min。上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，過0.22 μm聚四氟乙烯膜濾器，收集濾液并存儲在-80℃直至代謝物分析。以UHPLC-Q-TOF MS/MS結(jié)果所得特征峰個數(shù)和總峰面積為評價指標，對提取方法進行評價。

1.2.3 UHPLC-Q-TOF MS/MS分析

采用安捷倫1290 UHPLC色譜系統(tǒng)串聯(lián)6540 UHD accurate-mass Q-TOF質(zhì)譜儀對大米提取物進行分析。液相A液為0.1%(v/v)甲酸水溶液，B液為0.1%(v/v)甲酸乙腈水溶液。上樣前，色譜柱在85%A液中平衡。在分析過程中，樣品盤保持在4℃。分析時，樣品以隨機序列被注入到Acquity BEH C18色譜柱(2.1×150 mm，1.7 μm)，上樣量5 μL。質(zhì)量控制(QC)樣品每5次注射一次用于分析控制。在梯度洗脫中，流動相的流速設(shè)置為0.3 mL/min。質(zhì)譜分析條件為：一級質(zhì)譜采用射流電噴霧電離(Electrosprayionization，ESI)源，檢測方式：正離子模式，脫溶劑氣溫度：325℃，流速：9 L/min，掃描時間：0.5 s，掃描范圍：m/z 50-2000，霧化器壓力：45 psi，毛細管電壓：4000 V，進樣錐錐孔電壓：140 V，錐孔補償電壓：65 V，母離子累積時間，0.02 s/spectra；二級質(zhì)譜采用信息依賴型掃描(information dependent acquisition，IDA)，具體設(shè)置為Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ion to monitor per cycle：6，high sensitivity模式，去簇電壓：60 V，碰撞能量：35±15 eV，子離子累積時間，0.05 s/spectra，使用質(zhì)量校正離子對(m/z 301.998139和1033.988109)對系統(tǒng)進行校正。

實驗首先以獲得色譜峰個數(shù)及總峰面積為評價指標，對三種液相梯度洗脫方法(10min，23min，30min)進行了研究，在確定梯度洗脫方法的條件下，進而以色譜峰個數(shù)及出峰時間對三種色譜柱溫(25℃，30℃，40℃)進行考查。

表1液相色譜流動相梯度洗脫的方法
Tab.1 Gradient elution of UHPLC system

時間/min流動相A/%流動相B/%10min洗脫程序0100010.0455410.1100023min洗脫程序085151.585155.0455517.0307020.0109021.0851523.0851530min洗脫程序095522.0683222.5574323.0010023.5010024.095530.0955

1.2.4 數(shù)據(jù)處理分析

對得到的大米樣品的UHPLC-Q-TOF MS/MS原始數(shù)據(jù)利用MS Convert軟件將初始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為mzML格式。并使用在R軟件包(Ver.3.4.0)中運行的XCMS軟件進行預(yù)處理，包括對總離子流色譜原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取，峰對齊，去噪音等處理，得到各個峰的保留時間、峰高、去噪音等處理，得到各個峰的保留時間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理后，生成由保留時間(RT)和質(zhì)量荷電比(m/z)數(shù)據(jù)對組成的二維矩陣。

1.2.5 UHPLC-MS/MS方法的評價

重現(xiàn)性：按最佳前處理方法平行處理6份QC樣品，連續(xù)測定6次，數(shù)據(jù)預(yù)處理后，統(tǒng)計各代謝物保留時間和響應(yīng)值的相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分布，考察方法重現(xiàn)性。

精密度：實驗同時考察了UHPLC-Q-TOF MS/MS方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。日內(nèi)精密度的測定：取制備好的同一QC樣品分別在制備后的24小時內(nèi)的0，4 h，8 h，12 h和24 h時間點進樣，每次樣品平行檢測6次，統(tǒng)計各特征峰保留時間和響應(yīng)值的RSD分布，考察方法的日內(nèi)精密度。日間精密度的測定：取制備好的同一QC樣品分別在制備后的24 h，36 h和48 h時間點進樣，每次樣品平行檢測6次，統(tǒng)計各特征峰保留時間和響應(yīng)值的RSD分布，考察方法的日間精密度。

線性范圍：分別稱取QC樣品20，40，60，80，100，120，140和160 mg，按所確定的最佳前處理方法處理，每個樣品量平行處理3次。數(shù)據(jù)預(yù)處理后，統(tǒng)計各共有特征峰響應(yīng)值與樣品量間的線性相關(guān)系數(shù)(r)的分布，考察方法的線性范圍。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法的優(yōu)化

稻米作為植物學(xué)樣本，其代謝物種類繁多，且含量和極性差別較大，例如極性較強的糖、氨基酸類等，以及極性較弱的脂類、固醇類等代謝物[9]。不同的提取方法對樣品后期分析會產(chǎn)生極大的影響，本實驗采用不同提取試劑，料液比，提取方法及提取時間對稻米樣品進行提取，通過特征峰個數(shù)和總峰面積考察不同溶劑對稻米代謝物整體提取效率和穩(wěn)定性的影響。圖1顯示了不同條件對大米代謝物提取效率的影響。

(a.提取溶劑；b.提取料液比；c.提取方式；d.提取時間)(a.Material to liquid ratio;b.extraction solvent;c.extraction method;d.extraction time)圖1 不同提取條件對大米代謝物提取效率的影響Fig.1 Effects of different conditions on extraction efficiency of rice metabolites

實驗同時比較了不同配比的常用的三種提取溶劑，甲醇、乙腈和水對大米代謝物的提取效率。結(jié)果顯示(圖1a)，50%的甲醇提取到的特征峰個數(shù)(約9 348個)和總面積均最大，其次是甲醇-乙腈-水(1∶1∶1)和100%甲醇，100%乙腈和50%乙腈提取效果最差，僅有5 442和5 988個特征峰被檢測到，這可能是由于稻米當中糖類及其衍生物、氨基酸、有機酸等極性物質(zhì)較多，所以極性較強的甲醇溶液可以獲得更好的提取效果。適當?shù)牧弦罕瓤梢燥@著增強大米代謝物的提取效率。如圖1b所示，料液比為1∶3時，原料由于無法被充分浸潤而導(dǎo)致提取效率過低(僅有3 792個特征峰被提取)；當料液比大于1∶5后，提取出的代謝物總數(shù)增加并不顯著，但代謝物總面積卻因為溶劑過多以致代謝物濃度降低而降低。因此料液比1∶5被選定為后續(xù)實驗的料液比條件。圖1c顯示了輔助超聲、恒溫振蕩、渦旋3種常見的提取方法對水稻中物質(zhì)提取效率的影響。其中輔助超聲和恒溫振蕩提取時間為30 min，渦旋提取則選擇30 min，每5 min間歇1 min的方式。由圖1c可以看出，超聲提取方法得到的代謝物個數(shù)(8 664個特征峰)和總峰面積(約7.88×106)均優(yōu)于其他兩種方法，且超聲提取操作簡單，所以選擇超聲提取方式進行進一步的篩選實驗。在對提取時間的篩選實驗中發(fā)現(xiàn)，較短的提取時間通常會保護代謝物的結(jié)構(gòu)不受到提取過程的損壞(溫度過高及機械損害)，但過短的時間(5 min)也導(dǎo)致提取不完全的現(xiàn)象發(fā)生，因此實驗選擇30 min作為后續(xù)實驗的提取時間。

2.2 UHPLC條件的優(yōu)化

2.2.1 UHPLC梯度洗脫條件的優(yōu)化

如何將經(jīng)預(yù)處理的樣品快速而穩(wěn)定的分離和檢測是UHPLC-MS/MS技術(shù)的關(guān)鍵。流動相梯度的變化能引起流動相極性的變化，從而調(diào)節(jié)樣品中各組分在流動相中的分配系數(shù)(K值)，以達到各組分良好的洗脫和分離的目的[10]。本實驗以液相色譜所得色譜峰數(shù)量和總色譜峰面積為指標，對三種梯度洗脫條件(10 min，23 min，30 min)對UHPLC-Q-TOF MS/MS的檢測能力的影響進行考察。

表2不同流動相梯度洗脫效果的評價
Tab.2 Evaluation of different gradient elution

梯度洗脫條件/min色譜峰數(shù)量/個色譜峰面積/×107108421.19±0.052319014.21±0.193024791.69±0.03

流動相梯度的變化導(dǎo)致化合物保留屬性的改變，根據(jù)化合物相似相溶原理，極性的改變將改變化合物在固定相和流動相間的分配系數(shù)，達到洗脫的目的[11]。如表2所示，流動相極性的改變可以改變化合物的出峰個數(shù)，10 min對樣品的洗脫能力較低，僅有842個色譜峰被分離出來；而30 min的洗脫則分理出2 479個色譜峰；但從色譜峰面積來看，30 min洗脫條件雖獲得了較多的色譜峰數(shù)量，但總峰面積較低，僅為1.69±0.03×107，而23 min梯度洗脫技能獲得相對較多的色譜峰數(shù)量(1 901個)，還可兼顧得到較高的色譜峰面積(4.21±0.19×107)。因此在本研究中，23分鐘梯度洗脫是最佳的流動相梯度，在該條件下，化合物得到有效的分離，同時檢測容量也最大。

2.2.2 UHPLC色譜柱柱溫的優(yōu)化

通常情況下，色譜柱的柱溫被控制在室溫，然而對于大批量樣品而言，長時間的UHPLC-MS/MS分析會導(dǎo)致柱溫的變化，進而引發(fā)化合物的保留屬性和色譜柱的柱效的變化[12]。本實驗在確定流動洗脫條件的前提下，以液相色譜所得色譜峰數(shù)量，出峰時間和總色譜峰面積為指標，對三種色譜柱溫(25℃，30℃和40℃)對UHPLC-Q-TOF MS/MS檢測能力的影響進行考察。

柱溫是高效液相色譜中比較重要但又常被忽略的因素。本研究我們考察了UHPLC-Q-TOF MS/MS系統(tǒng)在25℃，30℃和40℃三個不同溫度下檢測能力的差異，結(jié)果表明：柱溫的改變導(dǎo)致化合物保留屬性的改變，這主要是因為溫度的升高促進了化合物從固定相中解吸的過程。如圖2所示，特征峰1(紅色箭頭)相對保留時間為7.13 min，而當柱溫升高至40℃時，相對保留時間變成了5.98 min，整個出峰時間縮短了1.15 min。從整體洗脫程序上來看，25℃時，主要色譜峰約在21 min出峰完畢，當柱溫上升到40℃時，主要色譜峰出峰結(jié)束時間提前至18 min左右，整體出峰時間縮短約3 min。由此說明，升高柱溫，可以加快化合物的出峰時間而縮短分析時間，減少流動相的使用，節(jié)約分析成本。一般而言，柱溫越高，分離效率越高，分析時間越短，還可以降低柱壓，改善峰形等[12]。但是高溫一方面造成色譜柱填料的降解，減少色譜柱的使用壽命，另一方面容易引起色譜峰的分離程度降低，甚至造成雙峰和平峰現(xiàn)象(紅色虛線橢圓)。實驗同時考察了色譜柱溫對色譜峰個數(shù)的影響和總峰面積的影響。

(a.25℃，b.30℃，c.40℃)(a.25℃,b.30℃,c.40℃)圖2 液相色譜色譜柱溫的優(yōu)化Fig.2 Temperature optimization of chromatographic column applied in LC-MS/MS analysis

表3不同柱溫對液相色譜影響的評價
Tab.3 Evaluation of different column temperatures

柱溫條件/℃色譜峰數(shù)量/個色譜峰面積/×1072517993.97±0.233018214.52±0.074017674.12±0.62

由表3可以看出，色譜柱溫的變化會引起色譜出峰數(shù)量和色譜峰面積的變化，隨著柱溫從25℃上升至30℃，可識別的色譜峰數(shù)量由1 799個增加至1 821個，然而當柱溫從30℃上升至40℃后，色譜峰數(shù)量下降至1 767個，這與圖2結(jié)果吻合，圖2b中12～16 min的色譜峰，在升高柱溫后發(fā)生了部分色譜峰的聚集及平峰現(xiàn)象(圖2c中11～15 min)。色譜峰分離度的下降會引起質(zhì)譜檢測的誤差增大，因此本實驗中色譜柱溫控制在30℃。

2.3 UHPLC-Q-TOF MS/MS方法的評價

為了確定上述研究中建立的UHPLC-Q-TOF MS/MS測定稻米代謝物的方法是否符合實際檢測需要，實驗以色譜峰的響應(yīng)值的RSD和相關(guān)系數(shù)r為指標，從重復(fù)性，日內(nèi)、日間精密度及線性范圍四個方面對方法進行評價。

實驗對重復(fù)性的考察結(jié)果(圖3a)表明，有83.09%特征峰峰面積RSD小于20%，其峰面積累積響應(yīng)值占全部特征峰的78.82%，峰面積RSD小于30%的占總個數(shù)的91.78%，其峰面積累積響應(yīng)值占全部代謝物的88.65%以上。保留時間的RSD值僅為2.32%，由此可看出該方法的重復(fù)性較好。

通過連續(xù)3天對QC樣品進行檢測，并計算特征峰保留時間和峰面積RSD進行日內(nèi)、日間精密度分析發(fā)現(xiàn)，保留時間的日內(nèi)和日間RSD值均在5%以內(nèi)(3.2%和4.7%)；日內(nèi)QC樣本特征峰面積的RSD百分比在30%以內(nèi)的有91.98%(圖3b)，日間QC樣本特征峰面積的RSD百分比低于30%的也達到了90.18%(圖3c)，說明該方法穩(wěn)定性良好。

圖3 UHPLC-Q-TOF MS/MS方法的評價Fig.3 Evaluation of UHPLC-Q-TOF MS/MS method

在非靶向UHPLC-Q-TOF MS/MS分析中，可能會存在一些結(jié)構(gòu)未定的物質(zhì)，所以很難采用常規(guī)方法對各物質(zhì)進行線性范圍的考察。本研究中稱取20～160 mg樣品，經(jīng)50%甲醇提取分析后，計算各質(zhì)譜特征峰的峰面積與樣品量間的線性相關(guān)系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3d)約有67.25%的代謝物響應(yīng)與樣品量間的線性相關(guān)系數(shù)(r)大于0.9，線性相關(guān)系數(shù)大于0.8的物質(zhì)約占84%，說明在20～160 mg樣品量范圍內(nèi)，大部分物質(zhì)響應(yīng)值與其對應(yīng)樣品量間線性關(guān)系良好，該方法比較穩(wěn)定可靠。

2.3 方法的應(yīng)用

為了檢驗已建立的UHPLC-Q-TOF MS/MS方法對大米代謝物的提取和分離效果，我們選取兩種不同大米樣品進行測定，檢測兩種稻米所得總離子流色譜圖如圖4所示。

通過比較儀器色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，前文中所建立的UHPLC-Q-TOF MS/MS方法對大米代謝物的提取效果和分離程度較好。稻米代謝物的組分極性范圍較寬，從高極性到低極性的化合物均能在基峰色譜圖中有所體現(xiàn)：在0～8 min主要集中的是極性大的組分；在12～18 min主要集中的是極性較小的部分。8～10min期間組分峰較少，可能是由于該時間段內(nèi)化合物較少或組分離子化程度不高。UHPLC-Q-TOF MS/MS檢測結(jié)果經(jīng)色譜峰的提取，峰對齊，去噪音等處理，共得到9 146個特征峰，其中第一個稻米樣品8 233個，第二個稻米樣品8 756個，兩種樣品共有特征峰7 843個，占總特征峰的85.8%。后期可以通過質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果進行匹配，并結(jié)合保留時間、特征離子、相對豐度以及相關(guān)文獻對化合物進行鑒定和進一步的統(tǒng)計分析。

圖4 兩種稻米樣本的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of rice samples

3 結(jié)論

本文通過對稻米代謝物的提取方法(包括提取試劑、提取料液比、提取方法及提取時間)和液相色譜分離方法(包括流動相洗脫和色譜柱溫)進行篩選和優(yōu)化，建立了利用UHPLC-Q-TOF MS/MS技術(shù)對稻米代謝物的分析方法。最終確定代謝物的最佳提取方式為；在料液比1∶5的情況下，50%甲醇經(jīng)超聲提取30 min可獲得較好的提取效果。代謝物的最佳液相洗脫條件為30℃色譜柱溫的條件下在乙腈-水-甲酸流動相體系以0.3 mL/min的流速梯度洗脫23分鐘。該方法具有良好的重現(xiàn)性、日內(nèi)/日間精密度以及線性關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，利用該方法對兩種稻米樣品進行分析，實驗結(jié)果顯示，共得到9 146個特征峰，其中第一個稻米樣品8 233個，第二個稻米樣品8 756個，兩種樣品共有特征峰7 843個，占總特征峰的85.8%，說明該方法對于大米代謝物的提取和分離穩(wěn)定有效。在今后的研究中，可以通過色譜峰的比對和質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果對大米代謝物進行識別和鑒定，進一步對液質(zhì)聯(lián)用所得結(jié)果進行分析。