溫光誘導(dǎo)下甜菜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

梁乃國，程大友，崔 杰，代翠紅，羅成飛

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱 150090)

0 引言

溫度和光周期是植物開花的兩個(gè)主要環(huán)境因素。當(dāng)環(huán)境條件最有利時(shí)開花是植物生殖生長重要的適應(yīng)性特征。春化是植物對溫度的一種適應(yīng)性，植物長時(shí)間暴露于低溫條件下之后獲取開花能力的過程。春化作用誘導(dǎo)細(xì)胞的快速分裂，分生組織一旦長時(shí)間處于春化環(huán)境，它們不但會(huì)記住春化作用，而且該記憶在有絲分裂上是穩(wěn)定的。大多數(shù)植物的開花需要春化和長日照光周期的誘導(dǎo)作用，長日照光周期為開花提供了保證，研究光周期誘導(dǎo)植物開花的分子機(jī)制表明，光感受器和晝夜節(jié)律性調(diào)節(jié)以復(fù)雜的方式相互作用控制開花的轉(zhuǎn)變，光周期誘導(dǎo)開花是晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的輸出通路。擬南芥的春化和光周期誘導(dǎo)開花的分子機(jī)制已經(jīng)研究得比較清楚。但是甜菜作物中的春化和光周期途徑誘導(dǎo)開花的分子機(jī)制仍不明確，最近的研究表明，除了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外，春化和光周期誘導(dǎo)開花的機(jī)制還受到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)降解作用的調(diào)節(jié)。因此，研究不同條件下甜菜不同發(fā)育時(shí)期蛋白質(zhì)組學(xué)的表達(dá)差異可以進(jìn)一步明確春化和光周期途徑的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 生物材料及處理方法

實(shí)驗(yàn)材料為糖甜菜品系DY14-O，該材料為二倍體、糖甜菜品系。選大小基本一直的母根200個(gè)，用鋼鋸沿著甜菜母根根體縱向平均分瓣，對應(yīng)編上號(hào)碼，共400瓣。其中200瓣春化(4-5℃)處理16周(16W);另外對應(yīng)的200瓣在正常條件下(非春化條件下)處理16周(16W)。在春季將二者同時(shí)移栽到試驗(yàn)田中，200瓣春化甜菜中的100瓣長日照(光照16 h/黑暗8 h)條件下生長，其余的100瓣短日照(光照8 h/黑暗16 h)條件下生長。另外的200瓣非春化甜菜中的對應(yīng)的100瓣長日照(光照16 h/黑暗8 h)條件下生長;另外對應(yīng)的100瓣短日照(光照8 h/黑暗16 h)條件下生長。在甜菜苗期(16W)、抽薹期(19W)和現(xiàn)蕾期(20W)分別采集葉片，用錫箔紙包好后迅速放入液氮中速凍轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

利用(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)對保存的樣品—甜菜春化長日照與春化短日照、春化長日照與非春化長日照、春化短日照與非春化短日照、非春化長日照與非春化短日照的苗期(16W)、抽薹期(19W)和現(xiàn)蕾期(20W)葉片中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異進(jìn)行分析，以期明確春化、光周期誘導(dǎo)對甜菜蛋白質(zhì)組學(xué)差異的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)鑒定

如表1所示，通過對甜菜春化長日照和春化短日照、非春化長日照和非春化短日照甜菜不同發(fā)育時(shí)期葉片中差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別進(jìn)行Significance A檢驗(yàn)，顯著性分析(p-Value，P<0.05為顯著性差異)共發(fā)掘出1 435個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

表1 差異蛋白質(zhì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

(P<0.05，ratio>1.2 or<0.833)

2.2 春化和光周期差異蛋白質(zhì)的GO富集和KEGG途徑分析

為了進(jìn)一步明確春化與非春化、長日照與短日照反應(yīng)的蛋白質(zhì)差異，將16W(苗期)、19W(抽薹期)和20W(現(xiàn)蕾期)鑒定出的差異蛋白質(zhì)(DRPs)應(yīng)用Blast2GO (Version 2.7.2)進(jìn)行GO富集分析，顯著性低于0.05認(rèn)為GO顯著性富集；然后應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG途徑繪圖分類特征化春化與非春化、長日照與短日照相關(guān)的DRPs功能序列，選擇P-value低于0.05的KEGG途徑分類為顯著性富集。春化與非春化的KEGG途徑分類結(jié)果表明“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氮代謝、谷胱甘肽代謝和二萜生物合成”的DRPs顯著富集，且在春化甜菜16W和20W特異性下調(diào);KEGG 途徑“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工“的DRPs在16W時(shí)富集，且在春化甜菜19W葉片中特異性上調(diào)；“苯丙素生物合成”的DRPs在16W和20W時(shí)下調(diào)而在春化甜菜19W時(shí)期的葉片中顯著上調(diào)，如表2所示。春化作用影響甜菜發(fā)育過程中的苯丙素生物合成、二萜生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工。光周期影響 “光合作用”，“光合作用天線蛋白質(zhì)”，“谷胱甘肽代謝”和“乙醛酸和二羧酸代謝”的DRPs高度富集，且在短日照16W和19W時(shí)特異性上調(diào)，而 “mRNA監(jiān)測途徑”的DRPs只在長日照20W時(shí)的葉片中富集。KEGG分類如表3所示。

表2 春化與非春化蛋白質(zhì)的KEGG途徑富集分析

表3 長日照與短日照光周期蛋白質(zhì)的KEGG途徑富集分析

2.3 春化和光周期協(xié)同作用的蛋白質(zhì)

將春化與非春化甜菜16W、19W和20W時(shí)葉片中的差異蛋白質(zhì)分別與長日照和短日照甜菜16W(苗期)、19W(抽薹期)和20W(現(xiàn)蕾期)時(shí)葉片中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合性篩選分析，篩選出春化與非春化、長日照與短日照同一時(shí)期共有的、顯著性變化的蛋白質(zhì)，甜菜16W春化和光周期協(xié)同作用的蛋白質(zhì)共39個(gè)，這些蛋白質(zhì)主要是核糖體蛋白，ATP合成蛋白和過氧化物酶體膜蛋白，其中春化和長日照光周期協(xié)同誘導(dǎo)30個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)表達(dá)，而非春化和短日照協(xié)同誘導(dǎo)9個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)。19W時(shí)春化和光周期協(xié)同作用的蛋白質(zhì)共22個(gè)，這些蛋白質(zhì)主要是核糖體蛋白，組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其中春化和長日照光周期協(xié)同誘導(dǎo)5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，而非春化和短日照協(xié)同誘導(dǎo)17個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)。20W時(shí)春化和光周期協(xié)同作用的蛋白質(zhì)共8個(gè)，這些蛋白質(zhì)主要是絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶和磷酸化酶蛋白、葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡糖苷酶和前體、半胱氨酸蛋白酶和硫氧還蛋白，其中春化和長日照光周期協(xié)同誘導(dǎo)3個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，而誘導(dǎo)5個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá)。

2.4 甜菜抽薹和開花相關(guān)的蛋白質(zhì)

2.4.1 甜菜抽薹相關(guān)的蛋白質(zhì)

共鑒定出22個(gè)與甜菜抽薹相關(guān)的蛋白質(zhì)，如表4所示。這些蛋白質(zhì)分布為光合系統(tǒng)Ⅰ和光合系統(tǒng)Ⅱ蛋白質(zhì)、抗壞血酸過氧化物酶蛋白質(zhì)、40S核糖體蛋白質(zhì)S29、核糖體蛋白質(zhì)S14和60S核糖體泛素化蛋白質(zhì)、鐵氧還蛋白質(zhì)、組蛋白去乙酰化酶蛋白質(zhì)、組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)、過氧化物酶體蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)GO富集分類顯示電子載體活性相關(guān)的蛋白質(zhì)含有3個(gè)、催化活性相關(guān)的蛋白質(zhì)含有6個(gè)、分子結(jié)構(gòu)活性相關(guān)的蛋白質(zhì)含有2個(gè)、連接相關(guān)的蛋白質(zhì)含有15個(gè)，如圖1所示。電子載體活性相關(guān)的蛋白質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)活性相關(guān)的蛋白質(zhì)是甜菜抽薹期特有的，與抽薹直接相關(guān)。

表4 甜菜抽薹相關(guān)的蛋白質(zhì)

X表示春化與非春化，長日照與短日照處理，甜菜葉片中蛋白質(zhì)比值變化，顯著性為P<0.05。

注：Y軸表示蛋白質(zhì)的數(shù)量和百分比，X軸表示GO富集分類，A：電子載體活力B：催化活力C：結(jié)構(gòu)分子活力D：結(jié)合圖1 甜菜抽薹期春化和光周期協(xié)同誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)功能分類

2.4.2 甜菜抽薹相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用分析

植物體中的蛋白質(zhì)相互之間具有調(diào)控作用，形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了明確甜菜中蛋白質(zhì)之間的相互調(diào)控與抽薹發(fā)育的關(guān)系，將抽薹相關(guān)的蛋白質(zhì)通過String(http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。預(yù)測到4個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。葉綠體中的光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基psaK蛋白質(zhì)、葉綠體中光系統(tǒng)II核心復(fù)雜蛋白質(zhì)psbY、葉綠體中光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基N、葉綠體中氧進(jìn)化蛋白質(zhì)增強(qiáng)子2、葉綠體中氧進(jìn)化蛋白質(zhì)增強(qiáng)子3和鐵氧還蛋白質(zhì)2形成相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，它們之間具有顯著性的相互作用，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)又與葉綠體中光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基VI蛋白質(zhì)具有顯著性的相互作用。值得注意的是抽薹相關(guān)的蛋白質(zhì)中有兩對顯著性相互作用的群體，一對由核糖體蛋白質(zhì)S14和泛素化60S核糖體蛋白質(zhì)L40組成；另一對由葉綠體中的鐵氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶催化鏈和光系統(tǒng)II磷蛋白質(zhì)組成。

圖2 抽薹相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析

2.4.3 甜菜開花相關(guān)的蛋白質(zhì)

共得到19個(gè)與甜菜開花相關(guān)的蛋白質(zhì)，如表5所示。它們的分布為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶核酮糖二磷酸羧化酶蛋白質(zhì)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶蛋白質(zhì)、葉綠素a-b結(jié)合蛋白質(zhì)硫氧還蛋白質(zhì)半胱氨酸蛋白酶抑制因子、半胱氨酸蛋白酶和光敏色素相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。GO富集分析表明抗氧化活性相關(guān)的蛋白質(zhì)是甜菜開花期特有的，與開花直接相關(guān)，如圖3所示。

表5 甜菜開花相關(guān)蛋白質(zhì)

續(xù)表5

X表示春化與非春化，長日照與短日照處理，甜菜葉片中蛋白質(zhì)比值變化，顯著性為P<0.05。

注：Y軸表示蛋白質(zhì)的數(shù)量和百分比，X軸表示GO富集分類，A：催化活力B：結(jié)合C：抗氧化活力圖3甜菜開花期春化和光周期協(xié)同誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)功能分類

2.4.4 甜菜開花相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用分析

甜菜開花相關(guān)的蛋白質(zhì)相互之間形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)甜菜開花。將開花相關(guān)的蛋白質(zhì)通過String (http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。預(yù)測到2個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，如圖4所示。一個(gè)是由葉綠體中的葉綠素a-b結(jié)合蛋白質(zhì)6、葉綠素a-b結(jié)合蛋白質(zhì)和葉綠素a-b結(jié)合蛋白質(zhì)4組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它們之間具有顯著性的相互作用。另一個(gè)是由1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基和核酮糖二磷酸羧化酶小鏈蛋白質(zhì)組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖4 開花相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析

3 結(jié)論

(1)春化作用影響甜菜發(fā)育過程中苯丙素生物合成、二萜生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工。光周期影響光合作用、乙醛酸和二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝和mRNA監(jiān)測途徑。

(2)春化和光周期協(xié)同誘導(dǎo)下，甜菜19W時(shí)期葉片中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)可能與甜菜的抽薹直接相關(guān)?？寡趸钚韵嚓P(guān)的蛋白質(zhì)和酶活性調(diào)節(jié)因子是甜菜20W時(shí)期特有的蛋白質(zhì)，表明這兩類蛋白質(zhì)可能促進(jìn)了甜菜的開花。