鹽酸特比奈芬凝膠微生物限度的檢查方法及效果

李雪杰 楊鐵兵 蔻友嬪

鹽酸特比萘芬凝膠為廣譜抗真菌藥物，能高度選擇性地抑制真菌麥角鯊烯環(huán)氧化酶，阻斷真菌細(xì)胞膜形成過程中的麥鯊烯環(huán)氧化反應(yīng)而干擾真菌固醇的早期生物合成，從而發(fā)揮抑制和殺滅真菌作用。通過實(shí)施生物限度檢查，合理解決鹽酸特比蔡芬乳膏中抑菌成分的干擾問題，能夠準(zhǔn)確、真實(shí)且有效反映藥物中存活污染的菌落數(shù)，而且檢出率較高。

取凝膠中的卡波姆（丙烯酸交鏈聚合物）及氯化鈣（鋇）結(jié)合形成鈣（鋇）鹽沉淀，最終保證凝膠順利通過微孔濾膜，避開沉淀物，達(dá)到破膠目的[1]。取1∶20 破膠，在經(jīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件篩選后，供試液1 ml稀釋后過膜，同時(shí)分次取900 ml 沖洗劑進(jìn)行沖洗， 使加菌回收獲得滿意果，并有效去除鹽酸特比奈芬凝膠抑真菌成分[2-3]。

1 材料與方法

1.1 材料

驗(yàn)證菌的種類：大腸埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）9 8001、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽抱桿菌CMCC（B）63 501、黑曲霉CMCC（F）98003。稀釋劑及培養(yǎng)基的選擇：膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白脈緩沖液。改良濃度為0.9%的無菌氯化鈉溶液，馬丁瓊脂培養(yǎng)基。

樣品：經(jīng)廣西康華藥物有限公司提供的鹽酸特比奈芬凝膠。

實(shí)驗(yàn)儀器的準(zhǔn)備：選擇六聯(lián)開放式薄膜過濾器、天平、電動(dòng)吸引器冰箱、高壓滅菌鍋以及培養(yǎng)箱、離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 制備供試液 取十四烷酸異丙酚30 ml，以及10 g 樣品，搖散、保溫。同時(shí)把保溫的pH 7.0 無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液加入其中，溫度為45 ℃，之后稀釋為100 ml，萃取并振搖。靜置分層后，取1∶10供試液的下層水相[4]。

1.2.2 制備菌液 培養(yǎng)18～24 h 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌的肉湯培養(yǎng)物于35 ℃溫度下培養(yǎng)，同時(shí)要制備成菌懸液，取0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行制備，會(huì)有50～100 cfu 的菌落數(shù)存在于每毫升的菌懸液中，留作備用[5]。同時(shí)培養(yǎng)24～48 h 0.9%無菌氯化鈉溶液制備成菌懸液，在25 ℃溫度下培養(yǎng)，為白色念珠菌液體培養(yǎng)物，同時(shí)會(huì)有50～100 cfu的菌落數(shù)存在于每毫升的菌懸液中，留作備用。將0.9%的無菌氯化鈉溶液3～5 ml 加入到培養(yǎng)了5～7 d的黑曲霉斜面培養(yǎng)物中，在25 ℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，洗掉霉菌的袍子，在制備成菌懸液時(shí)，需吸取濃度為0.9%的無菌氯化鈉溶液，會(huì)有50～100 cfu 的菌落數(shù)存在于每毫升的菌懸液中，留作備用。

1.2.3 檢驗(yàn)方法 供試品對(duì)照組：需在平皿中加入等量的供試液，之后即刻將瓊脂培養(yǎng)基加入到平皿中，等到凝固發(fā)生之后設(shè)置出規(guī)定的溫度，細(xì)菌需培養(yǎng)24～48 h，霉菌及酵母菌需培養(yǎng)48～72 h，制備2 個(gè)平皿，并測定供試品的本底菌數(shù)，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)[6]。（cfu 為菌落形成單位）

觀察組：需在平皿中把50～100 cfu 的試驗(yàn)菌及供試液加入，之后即刻將瓊脂培養(yǎng)基加入到平皿中，等到有凝固發(fā)生之后培養(yǎng)霉菌及酵母菌48～72 h，設(shè)置規(guī)定好的溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～45 h，并實(shí)施平行培養(yǎng)，制備2 個(gè)平皿。

稀釋劑對(duì)照組：需選擇1 ml 的pH 為7.0 無菌氯化鈉—— 蛋白胨緩沖液，以及50～100 cfu 的試驗(yàn)菌，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將其注入到平皿中。觀察稀釋劑是否會(huì)干擾到試驗(yàn)，另外此組各試驗(yàn)菌回收率需高于70%[7]。

菌液組：需在平皿中將50～100 cfu 的試驗(yàn)菌加入其中，之后需把瓊脂培養(yǎng)基加入到平皿中，等到有凝固發(fā)生之后培養(yǎng)霉菌及酵母菌48～72 h，設(shè)置規(guī)定好的溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～45 h，并實(shí)施平行培養(yǎng)，制備2 個(gè)平皿。

1.2.4 試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法 培養(yǎng)基稀釋法：在50～100 cfu/ 皿菌液，以及平皿（0.5 ml/皿、0.2 ml/皿）中，分別取1∶10 的供試液取0.2 ml、0.5 ml 分別注入，之后各制備出2 個(gè)平行皿，即刻將15～20 ml 的瓊脂培養(yǎng)基加入到平皿中，當(dāng)有凝固發(fā)生之后培養(yǎng)霉菌及酵母菌48～72 h，設(shè)置規(guī)定好的溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～45 h，并實(shí)施計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)菌回收率的測定。

常規(guī)法：需在平皿中分別把1 ml 的供試液及50～100 cfu 的菌液加入其中，制備出平行的皿2 個(gè)，之后需即刻將15～20 ml 的瓊脂培養(yǎng)基加入到平皿中，當(dāng)有凝固發(fā)生之后培養(yǎng)霉菌及酵母菌48～72 h，設(shè)置規(guī)定好的溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～45 h，并實(shí)施計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)菌回收率的測定。

薄膜過濾法：需在50 ml 的稀釋劑中將1∶10 供試液10 ml 加入其中，混勻并稀釋，取薄膜過濾法沖洗、過濾，0.1%的蛋白胨溶液是主要選擇的沖洗液，同時(shí)需把50～100 cfu 的試驗(yàn)菌加入到最后一次沖洗液中，細(xì)菌數(shù)在經(jīng)取出已經(jīng)沖洗的濾膜，貼到營養(yǎng)瓊脂平板上，同時(shí)要把玫瑰紅鈉瓊脂平板上貼上霉菌及酵母菌[8]。養(yǎng)霉菌及酵母菌48～72 h，設(shè)置規(guī)定好的溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～45 h，并實(shí)施計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)菌回收率的測定。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)平均回收率結(jié)果

通過培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml），金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌回收率均大于70%；稀釋 對(duì)照組各試驗(yàn)菌回收率須＞70%；通過薄膜過濾法（沖洗量300 ml），發(fā)現(xiàn)黑曲霉及白色念珠菌回收率均＞70%；可選擇培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml）實(shí)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)，酵母菌及霉菌計(jì)數(shù)均選擇薄膜過濾法（沖洗量300 ml）。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)平均回收率結(jié)果(%)

2.2 對(duì)比實(shí)驗(yàn)平均回收率結(jié)果

3 批樣品5 種試驗(yàn)菌回收率均＞70%。見表2。

表2 對(duì)比實(shí)驗(yàn)平均回收率結(jié)果(%)

3 討論

鹽酸特比奈芬凝膠是一種新型廣譜抗真菌藥物，按照我國藥典微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定，在對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證中，在建立有關(guān)微生物限度檢查法時(shí)，發(fā)現(xiàn)鹽酸特比奈芬凝膠微生物限度檢查方法的殺滅真菌作用及品種抑制均很強(qiáng)，尤其對(duì)于黑曲霉，具有更加顯著的作用。在檢查關(guān)于含有抑菌成分藥物的微生物限度時(shí)，要求需把供試品自身含有抑菌作用，在試驗(yàn)條件下有效排除掉，被檢微生物可實(shí)施正常生長繁殖，保證不干擾染菌的限度檢驗(yàn)[9-10]。細(xì)菌、酵母菌、真菌計(jì)數(shù)方法，驗(yàn)證試驗(yàn)菌回收率均＞70%。本研究在檢驗(yàn)鹽酸特比奈芬凝膠微生物限度中，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別選擇常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法3 種方法。本研究結(jié)果顯示，通過培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml），金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌回收率均大于70%；稀釋對(duì)照組各試驗(yàn)菌回收率須＞70%；通過薄膜過濾法（沖洗量300 ml），發(fā)現(xiàn)黑曲霉及白色念珠菌回收率均＞70%；可選擇培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml）實(shí)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)，酵母菌及霉菌計(jì)數(shù)均選擇薄膜過濾法（沖洗量300 ml）。經(jīng)結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)，3 批樣品5 種試驗(yàn)菌回收率均＞70%。同時(shí)，藥物中存活的污染的菌落數(shù)，可準(zhǔn)確、真實(shí)地反映出來，并具有較高的檢出率。

綜上所述，在進(jìn)行霉菌及酵母菌檢查中，選擇鹽酸特比奈芬凝膠薄膜過濾法，另外在進(jìn)行細(xì)菌數(shù)的檢查中，選擇培養(yǎng)基稀釋法，得出的結(jié)果可靠，方法可行。