蠐螬提取物對視網膜中央靜脈阻塞模型兔小膠質細胞CD68表達的影響及機制研究*

蔣鵬飛，董子奕，彭俊，馬俊旭，梁凱霞，彭清華

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.天津市人民醫(yī)院 眼科，天津 300121；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 眼科，湖南 長沙 410007）

視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）病程冗長，治療困難，尚無特效療法，視網膜新生血管是RVO的常見并發(fā)癥。文獻記載蠐螬可治療目疾，并有破血、行瘀、散結及明目的功效，前期研究發(fā)現(xiàn)蠐螬提取物可促進RVO出血的吸收，抑制視網膜新生血管[1-2]。為明確其機制，本文通過復制RVO動物模型，探討蠐螬提取物對視網膜新生血管的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用40只健康實驗性兔，雌雄兼用，體重1.8～2.3 kg（合格證號：湘醫(yī)動字第30-015號）。蠐螬提取物制備參考陽長明等[3]的方法。復方血栓通片（揚州中惠制藥有限公司），一抗為兔抗白細胞分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）多克隆抗體（武漢博士德公司），二抗為生物素標記的IgG（武漢博士德公司）。

1.2 設備

電子秤（JY0001，上海天平儀器廠），勒克斯照度計（ZDS-10，上海嘉定學聯(lián)儀器廠），眼科手術顯微鏡（YZZOT，蘇州醫(yī)療器械設備廠），PCR儀（德國Biometra公司），凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+，美國Bio-Rad公司），微量移液器（德國Eppendorf公司），垂直板電泳槽（DYCZ-24D，北京六一儀器廠），臺式高速冷凍離心機（美國賽默飛公司），水平電轉槽（DYCP-40C，北京六一儀器廠），超純水儀（美國Millipore公司），紫外可見分光光度計（SP-752，上海Spectrum公司），恒溫搖床（THZ-82A，金壇華特實驗儀器有限公司），水平搖床（WD-9405B，北京六一儀器廠），掃描儀（9000F MarkⅡ，日本Canon公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組將40只實驗性兔依次編為1～40號，通過隨機數(shù)字表法，從第3行第5個數(shù)開始抄錄40個數(shù)，將這些數(shù)字除以4，余數(shù)為1作為空白組，余數(shù)為2作為模型組，余數(shù)為3作為復方血栓通組，余數(shù)為0作為蠐螬組，最終每組10只動物，20只眼。

1.3.2 動物模型的復制應用光化學動力法復制實驗性RVO模型，模型組、復方血栓通組及蠐螬組兔雙眼散瞳后，麻醉動物，固定于裂隙燈前，安置三面鏡；激光器指示光斑定位于視盤邊緣的靜脈后，自耳緣靜脈緩慢推入20%熒光素鈉注射液（0.3 ml/kg），30 s內推完。注藥后，照射雙側視網膜靜脈，同時避開伴行的動脈，有明顯的遠端靜脈擴張時停止[4]。

1.3.3 動物給藥空白組、模型組以生理鹽水5 ml/kg灌胃；復方血栓通組：復方血栓通0.1 g/kg溶于生理鹽水制成混懸液，5 ml/kg灌胃；蠐螬組：蠐螬提取物1.5 ml/kg灌胃。各組均為1次/d，持續(xù)至模型復制后3周，各組于模型復制后1、3、7、14及28 d隨機處死2只動物。

1.3.4 取材動物耳緣靜脈注射空氣處死后，立即摘除眼球（包括球后視神經2 mm），于角膜緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)組織和玻璃體，手術顯微鏡下剝離眼球壁激光斑部位的視網膜，逐級酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，經視乳頭顳側旁開1 mm縱向做4μm厚的切片，烘干備用。

1.3.5 熒光素眼底血管造影術（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）模型復制后7、14及28 d對兔行FFA檢查，將FFA結果輸入Mias-2000型顯微圖像分析系統(tǒng)自動測量無灌注區(qū)和視盤的面積，并求出其比值[5]。分為無灌注區(qū)、有灌注區(qū)、無新生血管（甲類）、有新生血管（乙類）。

1.3.6 免疫組織化學法將取材的切片行蘇木精-伊紅染色，檢測CD68的表達。一抗為兔抗CD68多克隆抗體，二抗為生物素標記的IgG，在光學顯微鏡下觀察視網膜組織的變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組無灌注區(qū)與視盤面積比值比較

給藥7 d后，模型組中央靜脈熒光滲漏、出血，出現(xiàn)無灌注區(qū)，尚無新生血管出現(xiàn)；復方血栓通組和蠐螬組出現(xiàn)無灌注區(qū)，但滲漏、出血較模型組少。給藥28 d后，模型組滲漏、出血的靜脈周圍無灌注區(qū)面積增大，并出現(xiàn)新生血管；復方血栓通組滲漏、出血明顯減少；蠐螬組滲漏、出血基本吸收。復方血栓通組、蠐螬組與模型組給藥后7、14及28 d的無灌注區(qū)與視盤面積比值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的無灌注區(qū)與視盤面積比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.862，P=0.000）；②3組無灌注區(qū)與視盤面積比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=53.221，P=0.000）；③3組無灌注區(qū)與視盤面積比值變化趨勢比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.622，P=0.737）。見表1。

2.2 各組CD68的表達水平比較

空白組視神經小膠質細胞均表現(xiàn)為無表達或極少量表達（見圖1A）。模型組1 d時小膠質細胞增多（見圖1B），3 d時小膠質細胞數(shù)量達最高峰（見圖1C），7、14及28 d時小膠質細胞數(shù)量較前依次減少，28 d時多轉變?yōu)闂U狀的靜止狀態(tài)（見圖1D～F）。復方血栓通組小膠質細胞1 d時即有活化表現(xiàn)，3 d時活化達高峰（見圖2A～E）。蠐螬組小膠質細胞在1 d時同樣表現(xiàn)出了活躍的小膠質細胞，3 d時即表現(xiàn)出小膠質細胞受抑制，28 d時接近正常水平（見圖2F～I）。復方血栓通組、蠐螬組與模型組在1、3、7、14及28 d的CD68表達水平比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點CD68表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.373，P=0.000）；②3組CD68表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=92.425，P=0.000）；③3組CD68表達的變化趨勢比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.743，P=0.569）。見表2。

表1 各組不同時間無灌注區(qū)與視盤面積比值比較 （n =2，±s）

表1 各組不同時間無灌注區(qū)與視盤面積比值比較 （n =2，±s）

組別眼數(shù)7 d14 d28 d模型組416.34±3.5117.72±2.2019.42±2.69復方血栓通組411.88±2.148.22±1.974.18±1.75蠐螬組49.78±1.876.26±1.952.90±1.50

圖1 空白組和模型組不同時間小膠質細胞CD68的表達 （光學顯微鏡×400）

圖2 復方血栓通組和蠐螬組不同時間小膠質細胞CD68的表達 （光學顯微鏡×400）

表2 各組CD68表達水平比較 （n =2，±s）

表2 各組CD68表達水平比較 （n =2，±s）

組別眼數(shù)1 d3 d7 d14 d28 d空白組4194.06±9.37196.26±10.78191.12±2.44197.72±4.29194.96±3.21模型組4142.80±8.6985.90±5.01114.36±10.21144.86±6.24164.08±5.59復方血栓通組4146.16±8.26108.56±8.41128.54±9.63168.48±8.24182.56±4.88蠐螬組4143.18±3.53125.72±4.90160.78±6.34186.20±3.69197.42±2.21

3 討論

RVO發(fā)病率高，是僅次于糖尿病視網膜病變的第二大致盲性視網膜血管病，其發(fā)生機制目前尚不明了[6-11]。蠐螬是金龜子的幼蟲，首次記載于《神農本草經》：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚，青翳白膜?！薄稌x書》中有此藥治療目疾的記載：“吳中書郎戰(zhàn)沖，母王氏失明，婢取蠐螬蒸熟與食，王以為美，沖還知之，抱母慟哭，母目即開?！薄侗静菥V目》中記載此藥味咸微溫，有破血、行瘀、散結、通乳、解毒、消瘡及明目的功能?，F(xiàn)代藥理研究認為蠐螬對RVO的缺血視網膜組織有保護作用，能夠治療RVO所致的視網膜病理損傷[1-2]。

隨著視網膜作為免疫赦免區(qū)概念的打破，越來越多的學者開始研究小膠質細胞在視網膜疾病中的活化及作用，尤其是小膠質細胞的活化在RVO的相關研究中取得了一定的進展[12-14]。RVO時，組織出現(xiàn)缺血缺氧改變，小膠質細胞會迅速活化并趨附在損傷組織周圍。大量研究發(fā)現(xiàn)，視網膜上持續(xù)活化的小膠質細胞對視網膜神經元有損傷作用[15-18]。視網膜小膠質細胞的免疫組織化學表達較多，不同表達因子的選擇對實驗有一定影響[10，19-20]。本研究選取針對兔的CD68作為指標，CD68從形態(tài)上能很清楚地顯示小膠質細胞形狀的多樣性。

本研究發(fā)現(xiàn)，蠐螬提取物與復方血栓通均可改善RVO后組織灌注情況，但蠐螬提取物較復方血栓通效果更好。對視網膜小膠質細胞活化的表達因子CD68的檢測發(fā)現(xiàn)，復方血栓通和蠐螬提取物都使小膠質細胞的陽性表達隨時間的延長而減弱，3 d后蠐螬組比復方血栓通組的陽性表達減少，說明蠐螬提取物不僅能抑制RVO后小膠質細胞的活化，而且比單純的活血化瘀藥能更快地發(fā)揮對小膠質細胞的抑制作用，這應該與蠐螬提取物的免疫抑制作用有關。