中藥茜草抗氧化、抗炎、抗腫瘤不同藥用部位精準(zhǔn)研究＊

李 慧，包永睿，王 帥，李天嬌，孟憲生

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室 大連 116600）

茜草為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根及根莖[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明茜草有效成分具有抗炎、抗癌、抗氧化、止血、抗菌等多種藥理作用[2-6]，臨床應(yīng)用廣泛。現(xiàn)代研究多集中于茜草根的化學(xué)成分及其藥理藥效研究，有關(guān)茜草莖、葉、花的研究鮮有報(bào)道。有研究表明茜草葉富含氨基酸多糖，籽實(shí)富含天冬氨酸，含量分別是白洋參的4.2倍、野生人參的1.8倍、西洋參的2.3倍，有很大開發(fā)價(jià)值[7,8]，以茜草藤為主藥的中成藥“兒瀉?！保委熜焊篂a極為有效[9]，故茜草的地上部分同樣具有研究?jī)r(jià)值。目前對(duì)于茜草地上部分的研究，多以地上全草的化學(xué)成分及藥理藥效研究為主[10]，對(duì)其地上部分即莖、葉、花、果實(shí)的系統(tǒng)研究較少，故本實(shí)驗(yàn)開展了基于抗氧化、抗炎、抗腫瘤三種藥效的茜草根、莖、葉、花及果實(shí)的精準(zhǔn)研究，旨在對(duì)各藥用部位精準(zhǔn)、系統(tǒng)分析，從而明確其各藥用部位所對(duì)應(yīng)的精準(zhǔn)藥效及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)茜草各藥用部位的精準(zhǔn)應(yīng)用，擴(kuò)大茜草的藥用部位，為茜草資源的開發(fā)及臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

茜草全株自采于大連市童牛嶺風(fēng)景區(qū)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室許亮教授鑒定為Rubia cordifolia L.；2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二 銨 鹽（ABTS）試 劑（批 號(hào) ：F1813046，Aladdin Industrial Corporation）；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）試劑（批號(hào)：E1831033，Aladdin Industrial Corporation）；脂多糖（LPS）（批號(hào):813Q031），北京索萊寶科技有限公司）；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（批號(hào):J20180923EE，上海朗頓生物科技有限公司）；鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：G20180926GH，上海朗頓生物科技有限公司）；抗壞血酸（VC）（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；4-叔丁基茴香醚（BHA）（批號(hào)：507C051，北京索萊寶科技有限公司）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào):110753-201415，中國(guó)食品藥品檢定研究所），異牡荊素、云香柚皮苷、槲皮苷、新橙皮苷、山奈酚、茜草素、羥基茜草素、大葉茜草素對(duì)照品品均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為140924、 16072904、 151016、 150121、 17011305、17112309、17011011、18030107；異槲皮苷、大黃酸（批號(hào)：16040703、131024，四川省維克奇生物科技有限公司），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：796-9302，中國(guó)生物制品檢定所）；乙腈為色譜純（Tedia公司），磷酸為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），試驗(yàn)用水為純凈水(娃哈哈純凈水有限公司）。

1.2 細(xì)胞株

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株，人肝癌HepG2細(xì)胞株均購(gòu)自齊氏生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Agilent-1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent科技公司）；US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)NUAIRE公司）；Sartorius CP225D型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SUNRI SE酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 茜草不同部位HPLC指紋圖譜的建立

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0-15 min，5%-28%B；15-20 min，28%-30%B；20-25 min，30%-70%B；25-30 min，70%-75%B；30-40 min，75%-85%B；體積流量為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.4.2 樣品制備

稱取茜草根、莖、葉、花及果實(shí)粉末約（過二號(hào)篩）5.00 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，水浴加熱回流提取1 h，室溫條件下取續(xù)濾液適量，過0.22 μm濾膜，即得樣品溶液，取5 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，各樣品剩余濾液分別量取30 mL，真空干燥制備成干膏備用。茜草根、莖、葉、花及果的干膏得率分別為12.0%、11.2%、15.3%、13.6%及18.2%。

1.4.3 對(duì)照品制備

稱取茜草素、大黃酸、羥基茜草素、大黃酚、大葉茜草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含茜草素72 μg、大黃酸24.56 μg、羥基茜草素86.34 μg、大黃酚61.60 μg、大葉茜草素93.36 μg的混合對(duì)照品1溶液。稱取綠原酸、異牡荊素、異槲皮苷、蕓香柚皮苷、槲皮苷、新橙皮苷、山奈酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含綠原酸52.67 μg、異牡荊素100.02、異槲皮苷69.00 μg、蕓香柚皮苷42.06 μg、槲皮苷57.14 μg、新橙皮苷65.43 μg、山奈酚56.65的混合對(duì)照品2溶液。

1.5 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.5.1 DPPH方法

稱取DPPH適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.400 mg·mL-1的DPPH母液，以甲醇稀釋母液制備質(zhì)量濃度為0.040 mg·mL-1的DPPH工作液備用。稱取Vc對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.800 mg·mL-1的Vc母液，依次稀釋成質(zhì)量濃度0.040、0.030、0.025、0.020、0.015、0.010 mg·mL-1的系列Vc對(duì)照溶液。稱取根、莖、葉、花、果實(shí)醇提物適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為2.000 mg·mL-1的樣品溶液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.031、0.063、0.125、0.250，0.125、0.500、1.000 mg·mL-1的系列樣品溶液。取各樣品溶液與DPPH工作液各75μL于96孔板等體積混合，在酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)定光密度（OD）值，每個(gè)樣品平行做3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算各樣品清除率及茜草各部位EC50[11,12]。清除率（%）=[（A空白-A樣品）/A空白]×100%。

1.5.2 ABTS方法

稱取ABTS、K2S2O8適量，精密稱定，加純水制成濃度分別為 7 mmoL·mL-1、2.45 mmoL·mL-1的 ABTS、K2S2O8溶液，將兩溶液等體積混合，置于室溫避光孵育12h，即得ABTS+基液。以純水稀釋基液，使其734 nm處吸光度在0.7-0.8之間，制成ABTS+工作液。稱取BHA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.200 mg·mL-1的BHA對(duì)照品母液，依次稀釋成質(zhì)量濃度0.244、0.488、0.977、1.953、3.906、7.812 μg·mL-1的系列對(duì)照溶液。稱取根、莖、葉、花、果實(shí)醇提物適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為2.000 mg·mL-1的樣品溶液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為 0.031、0.063、0.125、0.25，0.125、0.500、1.000 mg·mL-1的系列樣品溶液。取各樣品溶液50 μL 與工作液 150 μL 于 96孔板混合，避光反應(yīng)6 min，在酶標(biāo)儀734 nm處測(cè)定光密度（OD）值，每個(gè)樣品平行做3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算各樣品清除率及茜草各部位醇提物EC50[13-15]。

1.6 抗炎實(shí)驗(yàn)

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞，在37℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[16]。

1.6.2 MTT法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞活力

調(diào)整RAW264.7細(xì)胞懸液密度，使其密度為6×104·mL-1，接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL。分別設(shè)置調(diào)零孔、空白對(duì)照孔（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、茜草提取物組（藥液質(zhì)量濃度為20、50、100、200、400 μg·mL-1），每組設(shè)定4個(gè)復(fù)孔。加藥后，將96孔板放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清，向每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，低速振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的OD值，細(xì)胞活力（%）＝（試驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%，篩選出對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響的藥液濃度進(jìn)行之后的實(shí)驗(yàn)[17]。

1.6.3 ILISA法檢測(cè)NO和IL-6含量

將RAW246.7細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105·mL-1，每孔100 μL，分別設(shè)置正常組、LPS組、LPS+茜草各部位醇提物組，每組4個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，正常組每孔加入培養(yǎng)液200 μL，LPS組每孔加入培養(yǎng)液180 μL、LPS溶液20 μL，給藥組每孔加入藥液（質(zhì)量濃度200 μg·mL-1）180 μL、LPS溶液20 μL，其中LPS組與LPS+茜草各部位醇提物組中LPS終濃度為500 ng·mL-1。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集各組上清液，按說明書檢測(cè)TNF-α和IL-6的水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行[18]。

1.7 抗肝腫瘤實(shí)驗(yàn)

人肝癌HepG2細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×103·mL-1接種于96孔培養(yǎng)板。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的待測(cè)樣品溶液及質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的順鉑溶液，待細(xì)胞貼壁后加入各待測(cè)樣品溶液200 μL，每個(gè)樣品平行做4個(gè)復(fù)孔，分為陽(yáng)性藥組，空白對(duì)照組，茜草不同部位醇提物給藥組。藥物作用24 h后，在酶標(biāo)儀490 nm處，測(cè)定各孔光密度（OD）值，并計(jì)算抑制率。抑制率（%）=[（對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值）]×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用ELISAcalc軟件計(jì)算NO、IL-6含量，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)）模型；采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用ANOVA單因素方差分析，其中P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果以形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

將茜草根、莖、葉、花、果實(shí)、混合對(duì)照品1和混合對(duì)照品2指紋圖譜文件導(dǎo)入軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012A版），得到譜圖，如圖1所示。共標(biāo)定31個(gè)色譜峰，從圖中可以看出根與莖、葉、花、果之間的色譜峰數(shù)量和峰面積差異較大，莖、葉、花、果之間差異較小，茜草根的色譜峰數(shù)最多，莖的色譜峰數(shù)最少。經(jīng)化學(xué)對(duì)照品比對(duì)出12種化學(xué)成分，分別是5-綠原酸、11-異牡荊素、12-異槲皮苷、15-蕓香柚皮苷、18-槲皮苷、19-新橙皮苷、22-山奈酚、23-茜草素、24-大黃酸、25-羥基茜草素、29-大黃酚、31-大葉茜草素（圖1，圖2）。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH法

DPPH法測(cè)定茜草根、莖、葉、花、果醇提物清除自由基能力結(jié)果（表1）。隨著茜草提取物質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率也隨之增加，經(jīng)SPSS21.0 Probit分析，計(jì)算出各部位EC50值，順序?yàn)楣靖厩o＞葉＞花，即茜草不同部位清除DPPH自由基順序?yàn)椋夯ǎ救~＞莖＞根＞果實(shí)；采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.2 ABTS法

圖1 茜草根、莖、葉、花、果HPLC指紋圖譜

圖2 混合對(duì)照品圖

ABTS法測(cè)定茜草不同部位醇提物清除自由基能力結(jié)果（表1）。隨著茜草提取物質(zhì)量濃度的增加，ABTS自由基清除率也隨之增加，經(jīng)SPSS21.0 Probit分析，計(jì)算出各部位EC50值，順序?yàn)楣靖厩o＞葉＞花，即茜草不同部位清除DPPH自由基順序?yàn)椋夯ǎ救~＞莖＞根＞果實(shí)；采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 抗炎活性

2.3.1 細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

茜草根、莖、葉、花、果醇提物對(duì)RAW246.7細(xì)胞的活力的影響（圖3）。作用時(shí)間24 h，藥液質(zhì)量濃度0.013-0.200 mg·mL-1的范圍內(nèi)，各組細(xì)胞存活率超過80%，細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，故選擇藥液濃度0.200 mg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3.2 NO和IL-6含量

經(jīng)ELISAcalc軟件進(jìn)行計(jì)算，logistic曲線（四參數(shù)）模型擬合。NO標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為：方程：y=（1.697909-0.954709）/[1+（x/11.557466）^1.239991]+0.954709，其中r2=0.999161，IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為：方程：y=（2.693269-0.284933）/[1+（x/33.841778）^1.201142]+0.284933，其中r2=0.991902。最終計(jì)算結(jié)果如表2所示，正常組細(xì)胞上清液中NO、IL-6分泌較少，給予500 ng·mL-1LPS刺激24 h后，NO、IL-6、TNF-α分泌均顯著增加（P ＜0.01），茜草根、莖、葉給藥組中NO、IL-6的分泌則受到明顯抑制（P＜0.05）。茜草根對(duì)炎癥因子分泌抑制作用最顯著，抗炎效果最好，果的抗炎效果最差。其中對(duì)于NO分泌的抑制作用，莖、花差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.294），對(duì)于IL-6分泌的抑制作用，各部位相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

表1 DPPH、ABTS法測(cè)定茜草不同部位醇提物清除自由基能力（清除率/%，xˉ±S，n=3）

圖3 茜草不同部位醇提物對(duì)RAW246.7細(xì)胞活力的影響

表2 茜草不同部位醇提物對(duì)NO、IL-6表達(dá)的影響（S ，n=3）

表2 茜草不同部位醇提物對(duì)NO、IL-6表達(dá)的影響（S ，n=3）

注：與LPS模型組比較：*P＜0.05

組別給藥劑量/(mg·mL-1）抑制率/%NO_ __ __ _76.5 38.88 48.18 64.72 15.59空白對(duì)照組LPS模型組根+LPS莖+LPS葉+LPS花+LPS果實(shí)+LPS 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 NO/(μmol·L-1)1.58±0.049*8.17±0.053 2.44±0.036*6.40±0.138*6.08±0.061*6.34±0.057*7.28±0.041*IL-6/(ng·mL-1)8.62±0.108*55.87±0.101 13.13±0.106*34.15±0.064*28.95±0.058*19.71±0.07*47.16±0.071*70.13 21.66 25.58 22.4 10.89 IL-6

表3 茜草不同部位醇提物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用（S，n=4）

表3 茜草不同部位醇提物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用（S，n=4）

注：與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05

抑制率/%52.23 16.19 0.05 17.86 7.82 43.11—組別茜草-根茜草-莖茜草-葉茜草-花茜草-果順鉑對(duì)照組OD平均值0.474 0.831 0.991 0.814 0.914 0.564 0.991標(biāo)準(zhǔn)差0.044 0.061 0.034 0.073 0.067 0.080 0.016

2.4 抗肝腫瘤活性

采用MTT法，檢測(cè)茜草根、莖、葉、花、果醇提物對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用（表3）。從表中可以看出，茜草根提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，其次是花、莖、果實(shí)，葉對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)抑制作用（P＞0.05）。

3 討論

茜草作為一味傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并將其列為上品，各本草典籍對(duì)于其入藥部位的描述以根居多[19]。除古書記載，現(xiàn)代研究也集中于根的化學(xué)成分及藥理藥效研究，對(duì)于茜草地上部分的研究較少。雖有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道地上部分的化學(xué)成分[20]，但均是針對(duì)全草分析，未對(duì)地上部分即莖、葉、花、果進(jìn)行區(qū)分研究。然而，不同的部位所含的化學(xué)成分群必然存在差異會(huì)導(dǎo)致藥效的差異[21]，所以，針對(duì)不同的藥效評(píng)價(jià)，應(yīng)精準(zhǔn)地選擇中藥用藥部位，這樣既可以減少用藥量，還能增強(qiáng)治療效果。故本課題組提出精準(zhǔn)生藥學(xué)概念，精準(zhǔn)生藥學(xué)是研究生藥采收時(shí)間、用藥部位化學(xué)成分差異和不同病癥療效關(guān)系的一門交叉學(xué)科，是生藥學(xué)前瞻性的分支。

本實(shí)驗(yàn)首先建立了茜草根、莖、葉、花、果醇提取物的高效液相紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各部位指紋圖譜色譜圖峰數(shù)量和峰面積存在較大差異，即化學(xué)成分的種類及含量有差異，通過化學(xué)對(duì)照品比對(duì)共鑒定出12種成分，包括黃酮及酚酸類7種，醌類5種，其中黃酮類成分與蒽醌類成分在圖譜中區(qū)分明顯，其中茜草根中所含醌類成分較多，莖、葉、花、果中幾乎不含有醌類成分，多為黃酮及酚酸類成分。之后進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，有文獻(xiàn)報(bào)道自由基能夠降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，造成活性氧的濃度增加，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而慢性炎癥在癌癥的發(fā)展中同樣起促進(jìn)作用[22-23]，因此自由基、炎癥及腫瘤三者之間存在一定關(guān)聯(lián)性。故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行茜草根、莖、葉、花、果醇提物抗氧化、抗炎及抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DPPH法與ABTS法結(jié)果一致，抗氧化活性順序均是花、葉、莖、根、果實(shí)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抗炎實(shí)驗(yàn)表明茜草根對(duì)于炎癥因子NO及IL-6分泌抑制作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抗肝腫瘤實(shí)驗(yàn)表明茜草根的效果最好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故筆者推測(cè)其抗炎及抗腫瘤藥效與其醌類成分密切相關(guān)，醌類成分對(duì)于炎癥及腫瘤的作用靶點(diǎn)可能相似。

綜上，茜草根、莖、葉、花、果實(shí)化學(xué)成分群存在差異，差異的化學(xué)成分群是茜草不同部位抗氧化、抗炎、抗腫瘤藥效顯著差異的重要因素。本實(shí)驗(yàn)明確了茜草花、葉的抗氧化作用較好，根的抗炎、抗腫瘤效果最好，故建議抗氧化選擇茜草花和茜草葉，抗炎、抗腫瘤選擇茜草根。本實(shí)驗(yàn)基于抗氧化、抗炎、抗腫瘤藥效對(duì)茜草不同部位進(jìn)行了精準(zhǔn)研究，為茜草資源的開發(fā)及合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。