車前草不同藥用部位抗炎、抗腫瘤、抗氧化的活性研究＊

崔琳琳，包永睿,2,3，王 帥,2,3，李天嬌,2,3，劉金瑛，孟憲生,2,3＊＊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 遼寧 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 遼寧 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室 遼寧 116600；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100029）

車前草，又名車輪草、豬耳草，屬車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前 Plantago depressa Willd.的干燥全草[1,2]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。性寒、味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有清熱、利尿通淋、涼血解毒、祛痰的功效，常用于治療癰腫瘡毒、水腫尿少、痰熱咳嗽等疾病[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，車前草中含有黃酮類、三萜類、多酚類、生物堿類等化學(xué)成分[6]。藥理活性方面，車前草除有利尿通淋、止瀉緩瀉作用外，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出潛在的藥用價(jià)值[7-9]。隨著近年車前草的價(jià)值被日益發(fā)掘，社會(huì)對(duì)其需求也越來越大。然而目前對(duì)于車前草的研究工作主要集中在資源調(diào)查、化學(xué)成分上，對(duì)藥效的研究主要集中在利尿，止瀉緩瀉上，對(duì)車前草不同用藥部位及其它藥效研究卻鮮有報(bào)道。本文旨在研究車前草不同藥用部位抗炎、抗腫瘤、抗氧化活性差異，進(jìn)一步明確車前草不同藥用部位的合理使用，擴(kuò)大車前草臨床用藥，更好地開發(fā)利用車前草資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺(tái)（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；SUNRISE酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；超低溫冰箱-80℃（海爾公司）；NKSY系列智能恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；USAUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)NUAIRE公司）；AE31型倒置相差顯微鏡（Motic公司）。

1.2 試劑

胎牛血清（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；胰蛋白酶、MTT（美國(guó)GIBCO公司）；對(duì)氨基苯磺酸、抗壞血酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；α-萘胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公祠）；DPPH、ABTS（北京索萊寶科技有限公司）；蘆?。ㄅ?hào)：17120702）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：16072904）、二氫槲皮素（批號(hào)：15060820）對(duì)照品均購(gòu)自于成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%；乙腈為色譜純（Merck公司）；水為超純水。

1.3 藥材

車前草藥材，取自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)本草園，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室許亮教授鑒定為車前科植物平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草。將車前藥材分為車前根、車前葉、車前子及除去根、葉、子后的剩余部位，于陰涼處干燥。

1.4 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2、小鼠RAW264.7均購(gòu)自齊氏（上海）生物科技有限公司。

1.5 指紋圖譜的建立

1.5.1 色譜條件

色譜柱：AgilentPoroshellSB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），填料：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：0.2%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0-10 min，5%→20%B，10-45 min，20%→38%B，45-50 min，38→100%B），流速0.8 mL·mm-1，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.5.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥后的車前不同部位藥材粗粉5.0 g置于150 mL具塞錐形瓶中，加入15倍量50%乙醇回流提取1 h，放冷，過濾。取續(xù)濾液1 mL，進(jìn)樣前過0.22 μm微孔濾膜做供試品溶液，其余液體濃縮成浸膏，收集浸膏，計(jì)算出膏率（根：9.3%、葉：28.8%、子：34.5%剩余部位：12.9%）。

1.5.3 對(duì)照品溶液的制備

取蘆丁、毛蕊花糖苷、二氫槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL約含0.2 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)解凍復(fù)蘇后，按本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)SOP常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)

1.7.1 抗炎活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]方法，取培養(yǎng)2-3天、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)1xPBS清洗兩次，每次3 mL，用刮刀刮取細(xì)胞，并用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104個(gè)·mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。精密稱取車前草不同藥用部位浸膏適量，加適量DMSO助溶，加培養(yǎng)液配制成不同濃度含藥培養(yǎng)液（給藥組濃度分別為0.04、0.06、0.08、0.1 g·mL-1生藥量），棄掉舊培養(yǎng)液，添加不同濃度含藥培養(yǎng)液，再添加100 μL LPS（終濃度為1μg·mL-1），混勻，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取出96孔板，每孔吸取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至新96孔板中，加入等體積Griess試劑，反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處吸光值。將舊96孔板中剩余培養(yǎng)液棄掉，每孔加100 μL MTT溶液（0.05μg·mL-1），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，小心吸去MTT溶液，每孔加入200 μL DMSO溶液，37℃恒溫?fù)u床振蕩15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm處吸光值。以細(xì)胞活力＞50%，NO抑制率≥50%，作為樣品具有抗炎活性的篩選指標(biāo)。

細(xì)胞活力（%）=樣品OD550/對(duì)照OD550×100

NO抑制率（%）=對(duì)照OD540-樣品OD540/對(duì)照OD540×100%

1.7.2 抗腫瘤活性測(cè)定

取培養(yǎng)2-3天、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞HepG2，經(jīng)1xPBS清洗兩次，每次3 mL，用1 mL胰蛋白酶（濃度為0.25%）消化，待細(xì)胞趨于變圓用培養(yǎng)液終止消化，并沖洗吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104個(gè)·mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)約12 h待細(xì)胞貼壁完全。精密稱取車前草不同藥用部位浸膏適量，加適量DMSO助溶，加培養(yǎng)液配制成不同濃度含藥培養(yǎng)液（給藥組濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g·mL-1生藥量）。設(shè)加藥試驗(yàn)孔、空白對(duì)照孔（加細(xì)胞，但不加藥物），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)，藥物作用一定時(shí)間后，每孔避光加20 μL（5 mg·mL-1）MTT，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸凈孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μLDMSO，搖床振搖10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm處掃描，測(cè)定吸光值。

圖1 車前不同藥用部位指紋圖譜疊加圖

細(xì)胞抑制率=(1-A給藥組/A空白組)×100%

1.7.3 抗氧化活性測(cè)定

（1）DPPH自由基清除能力

配置濃度為0.5 mmol·L-1的DPPH工作液。精密稱取車前不同藥用部位浸膏適量，加95%乙醇配制成生藥濃度為10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 mg·mL-1供試品溶液，取不同濃度供試品溶液和DPPH工作液各100 μL于96孔板中，每個(gè)濃度各取3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照加95%乙醇。避光反應(yīng)30 min后于酶標(biāo)儀中選取517 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，清除率按如下公式計(jì)算：

清除率=(A0-A樣)/A0×100%。A0為空白溶液，A樣為樣品溶液。

（2）ABTS自由基清除能力

配置濃度為 7.4 mmol·L-1的ABTS和2.6 mmol·L-1的K2S2O8。取適量ABTS和K2S2O8混勻，置于暗處室溫條件下靜置12-16 h得ABTS工作液。使用前用PBS稀釋至吸光度值為0.7±0.02。精密稱取車前不同藥用部位浸膏適量，加95%乙醇配制成生藥濃度為10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 mg·mL-1供試品溶液。吸取ABTS工作液100 μL，供試品溶液50 μL，充分混勻，避光放置6 min，于734 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度A，空白加95%乙醇。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，按1.7.3.1項(xiàng)下公式計(jì)算清除率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，所得各組數(shù)據(jù)均采用（s）表示。多組數(shù)據(jù)組間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 車前不同藥用部位指紋圖譜及共有峰的建立

取車前不同藥用部位樣品，按“2.1.2項(xiàng)”下方法制備各供試品溶液，按“2.1.1項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC測(cè)定與分析，記錄色譜圖，應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》（國(guó)家藥典委員會(huì)）軟件，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)入軟件，設(shè)置S2為參照?qǐng)D譜，系統(tǒng)生成對(duì)照?qǐng)D譜R，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)（圖1）。得到車前草不同藥用部位共有峰9個(gè)，保留時(shí)間分別為10.895，12.952，14.878，18.149，19.787，21.281，21.832，24.165，28.122 min。

2.2 共有峰指認(rèn)及相似度評(píng)價(jià)

采用車前指紋圖譜的色譜條件，根據(jù)保留時(shí)間并結(jié)合紫外吸收光譜全波長(zhǎng)掃描等方法，通過與大量的對(duì)照品進(jìn)行色譜比對(duì)，確定了車前草指紋圖譜中9個(gè)共有峰中3個(gè)峰的歸屬：6號(hào)峰為蘆丁，7號(hào)峰為毛蕊花糖苷，8號(hào)峰為二氫槲皮素。分別對(duì)車前根、葉、子、剩余部位的指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果見表1，除車前子外，車前根、葉、剩余部位的相似度較高，都大于0.93。由于車前子三個(gè)已知成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于其他各部位，且其他峰信息量也較少，因此車前子相似度對(duì)于其他入藥部位有所差別；同時(shí)葉的峰信息量和其豐度都比其他各部位大，其相似度與根和子也有差別，說明車前藥材各部位在具有一定的相似度的同時(shí)也存在部分差異。

表1 車前草不同藥用部位指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖2 車前草不同藥用部位NO抑制率

圖3 車前草不同藥用部位對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率

圖4 車前草不同藥用部位與Vc對(duì)DPPH自由基清除作用

2.3 抗炎活性

通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，Griess試劑法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO釋放量，能直觀反映炎癥的發(fā)生，因此以評(píng)價(jià)NO分子的分泌量來篩選抗炎藥物是一種普遍運(yùn)用且簡(jiǎn)單可行的方法[11]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，車前草不同藥用部位在選定的濃度范圍內(nèi)（0.04-0.1 g·mL-1）對(duì)Raw 264.7細(xì)胞活力無顯著影響，說明藥物在選定的濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒作用。NO抑制率隨藥物濃度的增加而增大，說明車前草不同藥用部位均有較好的抗炎作用，其中車前葉的抗炎作用最強(qiáng)，其次為車前草剩余部位和車前根，車前子抗炎作用相對(duì)較弱（與空白組抑制率為零相比，各藥用部位P均＜0.05）（圖2）。

2.4 抗腫瘤活性

車前草不同藥用部位對(duì)HepG2肝腫瘤細(xì)胞均具有顯著抑制作用，且隨著給藥濃度的增加，抗腫瘤作用增強(qiáng)。其中車前葉的抗腫瘤作用最強(qiáng)，其次為車前草剩余部位和車前根，車前子的抗腫瘤作用最弱。（與空白組抑制率為零相比，各藥用部位P均＜0.05）（圖3）。

2.5 抗氧化活性

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)還原劑存在時(shí)，可顯著清除其自由基，因此廣泛用于評(píng)價(jià)天然的抗氧化活性[12]。ABTS+是一種含氮自由基，在結(jié)構(gòu)中N原子上含有一對(duì)孤對(duì)電子，孤對(duì)電子與抗氧化劑結(jié)合使ABTS溶液顏色發(fā)生變化，如果所需要抗氧化劑的濃度越小，表明其清除能力越強(qiáng)[13]。陽性Vc對(duì)DPPH?自由基有清除作用，清除率與質(zhì)量濃度存在一定的量效關(guān)系，呈一定線性，可見本方法是可靠的（圖4）。車前不同部位醇提物在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，均具有較強(qiáng)的DPPH清除能力，隨質(zhì)量濃度增加，清除率上升，清除率與質(zhì)量濃度存在一定的量效關(guān)系。其中車前葉的清除DPPH能力最強(qiáng)，其次分別為車前草剩余部位、車前子，車前根抗氧化能力較弱（與Vc相比，各不同藥用部位P＜0.05）。同樣的結(jié)果可見ABTS+自由基清除能力（圖5）。

3 討論

車前草有廣泛的臨床用途、藥源豐富、廉價(jià)易得、具有很大的開發(fā)價(jià)值，逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。藥典規(guī)定車前用藥部位為車前科植物車前或平車前干燥全草或其干燥成熟種子，針對(duì)不同的疾病，合理應(yīng)用不同的藥用部位，增強(qiáng)中藥臨床療效，精準(zhǔn)用藥，是現(xiàn)代中藥研究的內(nèi)容之一[14,15]。

本研究以車前根、葉、子以及車前草剩余部位為研究對(duì)象，采用指紋圖譜技術(shù)從宏觀角度對(duì)其整體信息進(jìn)行了整合，建立了車前藥材4個(gè)不同藥用部位醇提物的指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)車前不同藥用部位醇提物化學(xué)成分之間既有相關(guān)性，又有區(qū)別，各共有色譜峰的相對(duì)峰數(shù)量及面積有一定差異，即化學(xué)成分種類及含量均有差異。

對(duì)車前藥材的不同藥用部位進(jìn)行了體外抗炎、抗腫瘤和抗氧化活性研究，藥效學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在相同的作用時(shí)間以及藥物濃度下，車前草的四個(gè)藥用部位均有較好的藥理活性，其中車前葉的抗炎、抗腫瘤及抗氧化活性均最高，表明車前葉具有很好的藥理活性。車前草剩余部位和車前葉具有相似的成分及藥理藥效活性，但藥效活性較車前葉低。車前根與車前子相比，車前子的抗炎和抗腫瘤活性較弱，但其抗氧化活性大于車前根。因此，車前草除有利尿緩瀉作用外，其抗炎、抗腫瘤、抗氧化也有較好的藥理活性。對(duì)于車前草不同藥用部位藥效活性差異以及具體發(fā)揮作用的成分及其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

圖5 車前草不同藥用部位與Vc對(duì)ABTS自由基清除作用

本研究為進(jìn)一步擴(kuò)大車前藥材的臨床用藥，不同藥用部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)深入研究提供一定的數(shù)據(jù)依據(jù)，為中藥材不同藥用部位的合理使用提供研究方法，對(duì)車前的開發(fā)和應(yīng)用以及車前藥用部位資源的擴(kuò)展及其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用具有重要的參考作用。