越橘低溫響應(yīng)因子VcICE1的克隆和功能鑒定

宋 楊，劉紅弟，王海波，張紅軍，劉鳳之

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省落葉果樹(shù)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)與肥料高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 興城 125100)

越橘亦稱藍(lán)莓，是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)植物，為多年生常綠或落葉灌木樹(shù)種。越橘作為我國(guó)一種新興的果樹(shù)作物之一，栽植面積和產(chǎn)量穩(wěn)步增長(zhǎng)[1-2]。低溫是影響植株生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)和產(chǎn)量形成的主要環(huán)境因子之一[3-8]，早春低溫和晚春霜凍對(duì)越橘直接造成傷害或間接影響開(kāi)花和坐果[9-10]。因此，探討越橘抗寒機(jī)制，提高抗低溫能力，對(duì)越橘抗寒育種具有重要意義。

不同果樹(shù)品種抗低溫能力差異較大，抗寒能力遺傳改良是減輕低溫傷害的有效途徑之一。越橘不同品種抗低溫能力差異較大，其對(duì)低溫耐受能力主要取決于低溫馴化程度[11]。在植物低溫馴化過(guò)程中，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)水平均會(huì)發(fā)生變化[12]。ICE1-CBF-COR低溫應(yīng)答通路是植物響應(yīng)低溫脅迫的主要信號(hào)傳導(dǎo)模塊之一[13-14]。ICE1(Inducer of CBF3 expression 1)為bHLH(Basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。在擬南芥中，AtICE1結(jié)合AtCBF3(CRT binding factor 3)啟動(dòng)子MYC結(jié)合位點(diǎn)(CANNTG)，激活A(yù)tCBF3的表達(dá)，AtCBF3促進(jìn)AtCOR(Cold-regulated)的轉(zhuǎn)錄，使擬南芥響應(yīng)低溫脅迫[15]。ICE1基因突變可抑制CBF3的表達(dá)，并削弱植株對(duì)低溫的抗性；超表達(dá)ICE1可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株低溫抗性[16-17]。

作為多年生木本植物越橘，低溫對(duì)樹(shù)體生長(zhǎng)具有重要影響。目前關(guān)于ICE1基因調(diào)控植物低溫抗性已有大量研究，但主要集中在水稻[18]、葡萄[19]和小麥[20]等物種中，越橘中ICE1同源基因的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究以抗寒性較強(qiáng)的越橘品種北陸為試材，分離并鑒定1個(gè)越橘I(mǎi)CE1基因VcICE1，通過(guò)表達(dá)模式、轉(zhuǎn)基因分析及瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)，探討VcICE1在調(diào)節(jié)越橘響應(yīng)低溫信號(hào)過(guò)程中的作用，為越橘抗寒育種提供背景資料。

1 材料和方法

試驗(yàn)于2017年5月-2018年9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所、農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的植物材料為5年生越橘品種北陸(VacciniumcorymbosumNorthland)及其組培苗、野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)。

將長(zhǎng)勢(shì)一致的越橘組培苗置于每天16 h光照，光強(qiáng)2 500～3 000 lx，溫度為4 ℃的光照培養(yǎng)箱中，分別在處理0，1，8，16，32 h后取葉片，液氮速凍后-70 ℃保存?zhèn)溆?。?duì)照置于光照培養(yǎng)箱中25 ℃條件下。野生型擬南芥用來(lái)遺傳轉(zhuǎn)化。本氏煙草用來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)。

1.2 基因克隆和序列分析

以擬南芥AtICE1和蘋(píng)果MdICE1基因?yàn)閰⒖夹蛄?，在越橘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[21]中進(jìn)行Blast檢索。以越橘葉片的cDNA為模板，根據(jù)檢索到的序列設(shè)計(jì)引物VcICE1-F/R擴(kuò)增開(kāi)放讀碼框序列(ORF)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶，連接到克隆載體pEAST blunt zero進(jìn)行測(cè)序。所用的引物序列見(jiàn)表1。

利用軟件Weblogo 3(http：//weblogo.threeplusone.com)分析VcICE1蛋白的保守序列。利用軟件Mega 6.0(http：//www. megasoftware.net)引入多個(gè)擬南芥bHLH蛋白，對(duì)VcICE1 蛋白進(jìn)行聚類分析。

1.3 RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析

分別提取越橘植株的根、1年生枝條(頂部第一和二節(jié)間部分)、幼葉、花(盛花期)和成熟果實(shí)(花后60 d)的總RNA，總RNA提取采用TaKaRa公司植物總RNA提取試劑盒(Code No.9769)。以總RNA為模板，使用MBI公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code No.K1621)合成cDNA。首先用普通PCR進(jìn)行序列驗(yàn)證，目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、回收后，進(jìn)行測(cè)序?；蛐蛄写_定后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析。內(nèi)參基因?yàn)閂cGAPDH。在擬南芥中，以AtUBQ10作為內(nèi)參基因。儀器為Bio-Rad公司CFX Connect PCR system，試劑為T(mén)hermoFisher公司PowerUpTMSYBRGreen Master Mix(Code No.A25742)。反應(yīng)體系：SYBR Mixture 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；每次循環(huán)第2步進(jìn)行熒光采集。最后采用2-ΔΔCT法分析定量數(shù)據(jù)。所有PCR都設(shè)3次重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR引物見(jiàn)表1。

1.4 擬南芥轉(zhuǎn)化和鑒定

構(gòu)建VcICE1-pRI101過(guò)量表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌侵染花序法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。在含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因植株。將抗性苗移栽至基質(zhì)中并放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。純合轉(zhuǎn)基因株系用于試驗(yàn)。具體參照Clough和Bent等[22]方法。載體構(gòu)建時(shí)使用的引物見(jiàn)表1。

表1 所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)

把含有ICE1蛋白結(jié)合位點(diǎn)，長(zhǎng)度為1 128 bp的AtCBF3啟動(dòng)子序列連接到pCAMBIA1301-GUS載體(AtCBF3pro-GUS)，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，與VcICE1-pRI101共注射煙草葉片。注射3 d后的煙草葉片用于GUS活性分析。稱取1 g葉片，使用GUS提取緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4pH值7.0，10 mmol/L EDTA，0.1% Triton X-100，0.1% 十二烷基氨酸鈉)提取葉片蛋白。使用康為世紀(jì)公司的BCA蛋白定量試劑盒(Code No. CW0014)對(duì)GUS蛋白進(jìn)行定量。具體參照Yin等[23]和Jefferson等[24]方法。

將VcICE1的ORF序列重組到pGreenⅡ62-SK載體(VcICE1-pGreenⅡ62-SK)，將AtCBF3的啟動(dòng)子序列重組到pGreenⅡ0800-LUC載體(AtCBF3pro-LUC)，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，注射煙草葉片。具體參照An等[25]試驗(yàn)方法。使用活體成像系統(tǒng)檢查熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。不同字母代表差異顯著(P﹤0.05)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘VcICE1的克隆、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得長(zhǎng)度約為1 600 bp的條帶。對(duì)所得片段測(cè)序分析，結(jié)果顯示，VcICE1的ORF長(zhǎng)度為1 566 bp，編碼含有522個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。使用Weblogo 3分析VcICE1及其他植物ICE1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明，VcICE1含有1個(gè)保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族(圖1)。將VcICE1與擬南芥bHLH蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)VcICE1與AtICE1(AtbHLH116)的同源性最高(圖2)。因此命名為VcICE1，GenBank登錄號(hào)為MH717245。

圖1 越橘VcICE1蛋白與其他植物ICE1蛋白的bHLH保守結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽Fig.1 The conserved domain logo of the VcICE1 in blueberry and other plant ICE1 protein

2.2 VcICE1和VcCBF3基因表達(dá)的分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析VcICE1和VcCBF3(GenBank登錄號(hào)為FJ222601)在越橘不同組織器官中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，VcICE1在幼葉中表達(dá)量最高，在果實(shí)中表達(dá)量最低。VcCBF3主要在幼葉中表達(dá)，其次在花中，在根、枝條和果實(shí)中表達(dá)均較低(圖3)。分析VcICE1和VcCBF3對(duì)低溫的響應(yīng)。結(jié)果表明，在低溫處理后1，8，16，32 h，與低溫處理0 h比較，VcICE1的表達(dá)量分別提高3.00，4.30，6.52，10.26倍，VcCBF3的表達(dá)量分別提高1.63，4.78，5.54，8.65倍。隨低溫處理時(shí)間的增加，這2個(gè)基因的表達(dá)量均表現(xiàn)持續(xù)上調(diào)，在處理后32 h達(dá)到最高(圖4)。

2.3 異位表達(dá)VcICE1提高轉(zhuǎn)基因擬南芥低溫抗性

為進(jìn)一步研究VcICE1的功能，構(gòu)建該基因的植物超量表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化侵染野生型擬南芥。實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系中VcICE1和AtCBF3的表達(dá)量，結(jié)果獲得OE-1和OE-2 2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因株系中VcICE1和AtCBF3的表達(dá)量均顯著高于野生型(圖5-A)。正常溫度(22 ℃)條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)無(wú)明顯差異。低溫(4 ℃)處理后，2個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的根長(zhǎng)分別為2.96，3.21 cm，野生型為1.81 cm，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)分別為野生型的1.63，1.77倍。轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)顯著高于野生型，說(shuō)明超表達(dá)VcICE1可能提高了轉(zhuǎn)基因植株的低溫抗性(圖5-B-C)。

圖2 越橘VcICE1和擬南芥bHLH蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic relationships of VcICE1 of blueberry and bHLH protein of Arabidopsis thaliana

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P﹤0.05)。圖4-7同。Different lowercase letter indicate significant differences(P﹤0.05). The same as Fig.4-7.

2.4 VcICE1促進(jìn)AtCBF3的表達(dá)

為研究VcICE1對(duì)冷信號(hào)途徑中其下游基因CBF3的調(diào)控作用，構(gòu)建VcICE1-pGreenⅡ62-SK和AtCBF3pro-LUC載體，以及VcICE1-pRI101和AtCBF3pro-GUS載體，并在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)。如圖6所示，共轉(zhuǎn)VcICE1和AtCBF3啟動(dòng)子的葉片中，其相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照，是對(duì)照的3.23倍。共轉(zhuǎn)葉片中相對(duì)GUS活性也顯著高于對(duì)照，為3.88倍(圖7)。說(shuō)明VcICE1可促進(jìn)AtCBF3的表達(dá)。

圖4 VcICE1和VcCBF3對(duì)低溫的響應(yīng)Fig.4 Expression of VcICE1 and VcCBF3 genes in response to cold

3 結(jié)論與討論

低溫是嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的要素之一。探討植物抗低溫能力，是多年來(lái)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題。闡明植物抗低溫脅迫的作用機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

A.定量PCR分析VcICE1、AtCBF3在轉(zhuǎn)基因擬南芥VcICE1-OE-1和VcICE1-OE-2中的表達(dá)水平；B.低溫處理下野生型和轉(zhuǎn)基因VcICE1擬南芥幼苗的根長(zhǎng)；C.野生型和轉(zhuǎn)基因VcICE1擬南芥幼苗耐低溫能力分析。A.qRT-PCR analysis of the expression level of VcICE1, AtCBF3 in VcICE1-OE-1 and VcICE1-OE-2 transgenic Arabidopsis; B.Relative root length of WT，VcICE1-OE-1 and VcICE1-OE-2 transgenic Arabidopsis; C.Phenotypes of WT，VcICE1-OE-1 and VcICE1-OE-2 transgenic Arabidopsis seedlings on chilling tolerance.

A.煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn);B.相對(duì)熒光強(qiáng)度。Ⅰ.VcICE1-pGreenⅡ62-SK和AtCBF3pro-LUC共同注射；Ⅱ. pGreenⅡ62-SK空載體和AtCBF3pro-LUC共同注射。A.Transient expression assay in tobacco leaf;B.Quantitative analysis of relative luminescence.Ⅰ. Co-injection of VcICE1-pGreenⅡ62-SK and AtCBF3pro-LUC;Ⅱ. Co-injection of pGreenⅡ62-SK and AtCBF3pro-LUC.

A.相對(duì)GUS活性。B.煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)：Ⅰ.pRI101空載體和AtCBF3pro-GUS共同注射；Ⅱ.VcICE1-pRI101和AtCBF3pro-GUS共同注射。A.Quantitative analysis of relative GUS activity; B.Transient expression assay in tobacco leaf：Ⅰ.Co-injection of pRI101 and AtCBF3pro-GUS;Ⅱ.Co-injection of VcICE1-pRI101 and AtCBF3pro-GUS.

目前，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)162個(gè)bHLH蛋白，其功能涉及抗逆、光信號(hào)傳導(dǎo)、激素信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝物質(zhì)合成等多個(gè)方面，其作用方式主要通過(guò)促進(jìn)或抑制啟動(dòng)子活性調(diào)控靶基因表達(dá)[26-35]。本研究從越橘中分離1個(gè)VcICE1基因，該基因編碼含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。VcICE1可與AtICE1(AtbHLH116)聚為一類，VcICE1與其他植物ICE1蛋白的保守功能域高度相似。因此，VcICE1可能是ICE1在越橘中的同源基因。

組織特異性表達(dá)分析顯示，擬南芥AtICE1在葉片和莖中表達(dá)量較高[15]。油菜BnICE1主要在下胚軸中表達(dá)[36]。蘋(píng)果MdICE1在葉片、休眠芽和花器官中大量表達(dá)，在春梢和愈傷組織中表達(dá)較弱[37]。在本研究中，VcICE1在幼葉中高表達(dá)，在根、枝條和果實(shí)中表達(dá)相對(duì)較低。這種時(shí)空表達(dá)的差異可能與不同物種特性有關(guān)。VcICE1與AtICE1及MdICE1均在葉片中高表達(dá)，暗示VcICE1可能與這2個(gè)物種的ICE1具有相似的調(diào)控植株響應(yīng)低溫的生物學(xué)功能。

Feng等[37]研究表明，蘋(píng)果MdICE1結(jié)合CBF啟動(dòng)子MYC結(jié)合位點(diǎn)，在擬南芥、煙草和蘋(píng)果中超表達(dá)MdICE1可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的低溫抗性[37]。擬南芥AtICE1響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達(dá)，可促進(jìn)其靶基因AtCBF3的轉(zhuǎn)錄提高植株低溫抗性，沉默AtICE1可抑制AtCBF3的表達(dá)，降低植株的低溫抗性[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，越橘VcICE1和VcCBF3均可響應(yīng)低溫信號(hào)上調(diào)表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明超表達(dá)VcICE1可提高擬南芥的低溫抗性。瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明，VcICE1可激活A(yù)tCBF3啟動(dòng)子活性。因此，越橘VcICE1與MdICE1及AtICE1的功能和作用方式相似，均是通過(guò)CBF途徑調(diào)控植株對(duì)低溫信號(hào)的響應(yīng)。

綜上所述，本研究克隆獲得越橘低溫響應(yīng)因子VcICE1，該基因可響應(yīng)低溫信號(hào)而上調(diào)表達(dá)。VcICE1轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)提高植株低溫抗性的表型。瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VcICE1可促進(jìn)AtCBF3的表達(dá)。該研究結(jié)果為深入探討ICE1基因調(diào)節(jié)越橘抗低溫脅迫機(jī)制提供了參考。