辣椒苗期抗感疫病比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

雷 陽(yáng)，成 妍，喬 寧，焦彥生，苗如意，楊玉花

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，山西 太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所，山西 太原 030031)

辣椒疫病(Phytophthorablight)是由辣椒疫霉菌(PhytophthoracapsiciLeonian)引起的一種土傳病害[1]，而辣椒疫霉菌是一種重要的植物病原卵菌，為害茄科、葫蘆科和豆類等多種農(nóng)作物以及可可樹等梧桐科植物。辣椒疫病是世界范圍內(nèi)最具破壞性的疾病之一[2]，在適宜條件下，其會(huì)導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量急劇降低，輕者減產(chǎn)20%～30%，重者減產(chǎn)90%，甚至絕收。目前，山西辣椒種植面積約5萬(wàn)hm2，由疫病引起的辣椒產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降、效益下滑的問(wèn)題已直接威脅到辣椒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，開展辣椒抗疫病轉(zhuǎn)錄組的研究對(duì)育種工作者針對(duì)抗性材料的篩選和改良具有必要性和緊迫性。

辣椒疫病在辣椒整個(gè)生育期均可發(fā)生，葉片受到辣椒疫霉菌侵染時(shí)，病斑呈現(xiàn)圓形或近圓形，然后逐漸擴(kuò)展到葉片邊緣，導(dǎo)致葉片軟腐并呈現(xiàn)黃綠色；花受侵染后變褐、脫落；受到其侵染時(shí)果蒂最先開始發(fā)病，最終霉?fàn)€[3]。辣椒疫病的發(fā)生以及流行主要與辣椒疫霉菌生長(zhǎng)的環(huán)境條件密切相關(guān)，主要包括溫濕度、栽培土壤的類型以及栽培方式等。辣椒疫霉菌主要以菌絲、厚垣孢子等形式在寄主植物的病株殘?bào)w、土壤、種子或其他寄主上越冬并存活下來(lái)，成為第2年的初侵染源。等到第2年條件適宜時(shí)，辣椒疫霉菌借助雨水或風(fēng)力等外界傳播媒介侵入寄主植物體內(nèi)的各個(gè)部位，從而引起病害發(fā)生[4-5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于辣椒疫病抗性育種工作研究不斷深入，結(jié)果表明，抗辣椒疫病是由多基因控制。因此，只有通過(guò)聚合高抗辣椒疫病品種優(yōu)良基因，才能選育出較好的抗疫病辣椒品種。目前，辣椒基因組測(cè)序的完成以及分子標(biāo)記技術(shù)和高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)的不斷進(jìn)步[6]，為辣椒抗疫病育種打下扎實(shí)的分子基礎(chǔ)，特別是新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展對(duì)辣椒育種研究起到了巨大的推動(dòng)作用，該技術(shù)可以在特定組織或細(xì)胞的某個(gè)時(shí)期來(lái)研究基因功能及結(jié)構(gòu)。前人已經(jīng)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法研究了辣椒的一些性狀，如對(duì)辣椒雄性不育轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析[7]，辣椒果實(shí)不同形態(tài)(鈴形和牛角形)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析[8]。其中，Wang等[9]對(duì)辣椒抗疫病材料PI201234轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果篩選到204個(gè)抗病基因，其表達(dá)模式包括細(xì)胞壁修飾、植保素合成、激素信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控4個(gè)方面。因此得出，利用RNA-seq技術(shù)可以快速全面發(fā)現(xiàn)特定組織、特定細(xì)胞內(nèi)起重要功能的基因，從而為育種工作奠定基礎(chǔ)。

目前，辣椒疫病危害巨大，其已被全球辣椒育種工作者高度重視。雖然，對(duì)辣椒疫病的抗性機(jī)制研究已有數(shù)十年，但到目前為止，抗病基因還未被全部克隆，相關(guān)抗病機(jī)理依然模棱兩可。

本研究利用RNA-seq分子生物學(xué)技術(shù)，從114份辣椒資源中篩選出對(duì)辣椒疫病產(chǎn)生抗性的相關(guān)基因，旨在今后的研究中可用來(lái)快速分辨辣椒資源的抗性，加快抗病育種進(jìn)度和辣椒抗疫病新品種的更新?lián)Q代，其對(duì)促進(jìn)辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)民增收具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用的辣椒材料均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所搜集并提供。在播種前選擇籽粒飽滿、顏色和大小一致的辣椒種子，首先在55 ℃溫水中浸種20 min，然后將種子均勻鋪在裝有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，于溫度為28 ℃、相對(duì)濕度為60%的全黑暗人工氣候箱中進(jìn)行催芽。大約在80%的種子露白后，就可以將其播在裝有基質(zhì)(腐殖質(zhì)∶珍珠巖=3∶1)的穴盤中，于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽(yáng)基地大棚中進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)材料設(shè)置 3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植10株。

辣椒疫霉菌菌株由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存并提供。首先將保存的病原菌進(jìn)行復(fù)壯，在超凈工作臺(tái)上將保存于石蠟油中的菌絲接種到PDA固體培養(yǎng)基(300 g馬鈴薯削皮切片，加入18 g瓊脂、20 g葡糖糖，置于微波爐中煮30 min(每10 min攪拌一次)，然后用紗布過(guò)濾去除殘?jiān)?，最后蒸餾水定容至1 000 mL)上進(jìn)行活化，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d[10]。待白色菌落形成后置于光下進(jìn)行孢子囊的誘導(dǎo)，大約2 d后，將產(chǎn)生的孢子囊刮到無(wú)菌水中，4 ℃下1 h，而后28 ℃下30 min促使游動(dòng)孢子的釋放。用高溫滅菌的紗布過(guò)濾，收集下層的濾液，然后在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水調(diào)整成最終濃度為 1×104個(gè)/mL的孢子懸浮液，備用。

待辣椒苗長(zhǎng)出4片真葉后，移入整理好的苗圃內(nèi)，并做好標(biāo)號(hào)。長(zhǎng)出6～8片真葉時(shí)，采用灌根法對(duì)其進(jìn)行疫霉菌接種。本試驗(yàn)采用的接種方法為灌根接種法[11]。接種15 d后，按農(nóng)業(yè)部1999年頒布的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查辣椒發(fā)病級(jí)別(表1)。

表1 辣椒疫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The standard classification of pepper Phytophthora blight

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間取樣和RNA提取 灌根15 d后調(diào)查植株發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)L1、L2和L4這3個(gè)材料屬于高感辣椒疫病材料，病級(jí)屬于4～5級(jí)；L3屬于高抗辣椒疫病材料，完全不發(fā)病，病級(jí)為0級(jí)。每個(gè)材料分別取10株混合樣，迅速置于液氮中冷凍，然后放在-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

利用TRIzol(Invitrogen，USA)試劑提取辣椒L1、L2、L3和L4整株混樣總RNA，然后利用RNase-free DNase Ⅰ(Thermo Scientific，USA)除去總RNA中殘余的DNA。利用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA)分光光度計(jì)檢測(cè)提取辣椒總RNA的濃度和純度。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序 將提取的4個(gè)辣椒樣品L1、L2、L3和L4的總RNA，參考劉峰等[8]的方法構(gòu)建特異性文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)片段富集，文庫(kù)大小一般在300～400 bp。然后參考Chen等[7]的方法進(jìn)行Agilen及文庫(kù)有效濃度檢測(cè)，樣品經(jīng)過(guò)RNA抽提、純化、建庫(kù)之后，送往生工生物工程(上海)有限公司，采用Illumina RNA-seq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。樣品經(jīng)測(cè)序后生成FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)，然后經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，要求平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于Q20。最后采用FastQC對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單堿基質(zhì)量、Base Content分布、GC Content分布、Sequence Base Quality 4個(gè)指標(biāo)的質(zhì)控分析。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析 將測(cè)序過(guò)濾后數(shù)據(jù)與參考基因組Pepper_Zunla_1_Ref_v1.0(NCBI)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)基因組注釋信息，可得到序列的來(lái)源基因以及表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。然后基于比對(duì)到基因的序列數(shù)目，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算表達(dá)量，并進(jìn)一步比較基因、轉(zhuǎn)錄本和外顯子在不同樣品和分組之間的表達(dá)差異[8]。采用 RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并在此基礎(chǔ)上以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1為條件篩選出2組樣本間差異表達(dá)基因。目的是為了能夠在樣品內(nèi)以及樣品間比較基因的表達(dá)量。其計(jì)算公式如下：

①

1.2.4 Real time-PCR 為了鑒定Illumina測(cè)序后篩選出的差異基因的不同表達(dá)模式，隨機(jī)選擇20個(gè)差異基因，然后利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。首先使用 Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，盡可能跨內(nèi)含子/外顯子邊界，以避免在實(shí)時(shí)定量RT-PCR時(shí)擴(kuò)增基因組DNA。每個(gè)樣品取3.0 μg 總RNA，利用TaKaRa公司 PrimeScript @ Reverse Transcriptase 試劑盒(商品編號(hào)：D2680A)方法(參考說(shuō)明書)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用大豆β-actin基因設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù) TaKaRa公司SYBR@ Premix ExTaqTM(Tli RNaseh Plus)(商品編號(hào)為 DRR420S)說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(ABI 7 300)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù) 3 次，最后利用2-ΔΔCT方法分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 四份辣椒材料在苗期的抗病性鑒定

將山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒課題組收集的114份辣椒材料/品種，在幼苗長(zhǎng)至6～8片葉時(shí)，接種辣椒疫霉菌。接種7 d后，按照農(nóng)業(yè)部1999年頒布的0～5級(jí)6個(gè)抗病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病級(jí)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，辣椒疫病6個(gè)病級(jí)，每級(jí)材料份數(shù)分別為3，7，11，25，36，32(圖1)。由此可以看出，抗辣椒疫病的材料較少，感疫病材料較多。本研究從0級(jí)抗病的3份材料中選擇1份抗病材料L3，從5級(jí)感病的32份材料中選擇L1、L2、L4這3份感病材料進(jìn)行后期深入研究。

圖1 辣椒田間病級(jí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.1 The statistics result of disease pepper in field

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)

4份辣椒材料苗期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和質(zhì)量檢測(cè)如表2，3所示。由表2可知，本次測(cè)序試驗(yàn)共獲得177 238 390條的 reads，總堿基數(shù)為26.59 Gb，每個(gè)樣品均獲得6.2 Gb以上的堿基。其中，Q20在97%以上，Q30在93%以上，GC含量均占43%。說(shuō)明試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量具有較高的可信度，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過(guò)對(duì)原始總數(shù)據(jù)質(zhì)量過(guò)濾后，L1、L2、L3和L4這4份樣本的Clean數(shù)據(jù)與表2中的數(shù)據(jù)量相比均有所下降，篩選后的有效數(shù)據(jù)量均在98%以上(表3)，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于Q20。

利用Tophat/Tophat2(基于Bowtie/Bowtie2)軟件成功地將82.66%～89.99%的Clean數(shù)據(jù)比對(duì)到辣椒參考基因組(http：//www.ensembl.org/)，并且有78.95%～85.11%的Clean數(shù)據(jù)比對(duì)到唯一的基因組位點(diǎn)(表4)。說(shuō)明4個(gè)樣品的Clean數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)效率較高。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 The statistical results of sequencing data

注：Qx 指質(zhì)量值大于或等于x的堿基所占的百分比。

Note：Qx means the percentage of quality value greater or equal to x base.

表3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)Tab.3 The result of transcriptome sequencing data

表4 四份辣椒材料RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與辣椒參考基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics of RNA-seq for pepper phytophthora blight of four pepper genotypes referring to pepper genome

2.3 辣椒抗疫病和感疫病2組材料差異表達(dá)基因分析

依據(jù)4份材料間的差異基因表達(dá)水平進(jìn)行PCA主成分分析，將相似材料進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示，L3的值遠(yuǎn)高于在同一組的L1、L2和L4這3份材料(圖2-A)，表明前期在材料篩選中足夠精確，試驗(yàn)設(shè)計(jì)也合理。采用 DESeq(Version 1.18.0)方法對(duì)辣椒抗疫病和感疫病2組材料間基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，通過(guò)成對(duì)比較可以消除基因型特異性轉(zhuǎn)錄組的背景干擾，從而獲得與抗病和感病相關(guān)的更多數(shù)據(jù)。首先篩選抗病和感病2個(gè)材料間的差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)倍數(shù)差異 |log2fold-change|>1，顯著性P-value<0.05。依據(jù)這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，將感病組的L1、L2和L4 這3個(gè)材料分別與抗病材料L3相比，結(jié)果顯示，分別得到1 127，1 165，1 062個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)基因分別為364，375，713個(gè)，下調(diào)基因分別為763，790，349個(gè)(表5)，有331個(gè)基因在 3組比對(duì)結(jié)果中均表現(xiàn)差異，包括68個(gè)上調(diào)基因和263個(gè)下調(diào)基因(圖2-B)。

圖2 四個(gè)辣椒材料PCA主成分分析圖(A)和差異基因表達(dá)維恩圖(B)Fig.2 PCA diagram of four pepper materials(A)and the Venn diagram showing the DEGs(B)

樣本Case參考樣本 Control上調(diào)表達(dá)基因Up-regulated genes下調(diào)表達(dá)基因Down-regulated genes總差異表達(dá)基因Total DEGsL1L33647631 127L2L33757901 165L4L37133491 062

2.4 利用qRT-PCR 熒光定量驗(yàn)證差異表達(dá)基因

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的差異基因的可靠性，隨機(jī)從2組材料篩選出的差異表達(dá)基因中挑選10個(gè)差異基因(包括5個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因)(表6)，采用熒光定量qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，熒光定量qRT-PCR檢測(cè)的隨機(jī)選擇的10個(gè)差異基因在4份辣椒材料中的表達(dá)模式與RNA-seq分析結(jié)果高度相似，進(jìn)而證實(shí)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序8個(gè)基因的表達(dá)水平與RNA-seq結(jié)果一致，其中，107861905基因在L2中幾乎不表達(dá)，107862280基因在L3中的表達(dá)量反而高于其他 3份感病材料(圖3)。因此，可以證明RNA-seq分析結(jié)果可靠。

表6 RNA-seq分析的10個(gè)表達(dá)差異基因Tab.6 10 DEGs in the RNA-seq analysis of four pepper materials

2.5 差異基因功能顯著性富集分析

Gene Ontology(GO)富集分析能夠全面描繪差異基因和基因產(chǎn)物的功能屬性，因此將其用于評(píng)價(jià)辣椒抗疫病和感疫病相關(guān)表達(dá)具有顯著差異基因的功能。根據(jù)P<0.05 的閾值來(lái)選擇，結(jié)果顯示，14 624個(gè)差異表達(dá)基因被富集，占全基因組的46.58%，將預(yù)測(cè)的和已知的轉(zhuǎn)錄本分成 3組，包括分子功能轉(zhuǎn)錄本、細(xì)胞組成轉(zhuǎn)錄本和生化過(guò)程轉(zhuǎn)錄本。本研究具體分析在 3組比對(duì)中都表現(xiàn)出差異的331個(gè)差異基因，其中，有223個(gè)基因被GO富集、41個(gè)上調(diào)基因、182個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)排列前10的 GO分類可以看出(表7)，上調(diào)差異基因和下調(diào)差異基因主要功能是分子功能和生化過(guò)程，而細(xì)胞組成分類很少。其中，分子功能主要子類有氧化還原酶活性、碳氧裂解酶活性、過(guò)氧化物酶活性等，而生化功能子類主要是代謝過(guò)程和逆境響應(yīng)過(guò)程。以上結(jié)果可以說(shuō)明，差異基因編碼不同的酶類活性、代謝過(guò)程和逆境響應(yīng)，這些可能與辣椒抗疫病和感疫病差異相關(guān)的基因有關(guān)。

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證10個(gè)隨機(jī)選擇的差異表達(dá)基因Fig.3 Validation of 10 randomly chosen DEGs by qRT-PCR

與整個(gè)轉(zhuǎn)錄組背景相比，共有117個(gè)差異基因歸入KEGG通路，其中，包括25個(gè)上調(diào)差異基因，92個(gè)下調(diào)差異基因。在這些通路中，RNA退化、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、氧化磷酸化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理和氨基酸的生物合成是上調(diào)差異基因?qū)?yīng)的前5個(gè)通路(表7)。而下調(diào)差異基因?qū)?yīng)的前5個(gè)通路，分別為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷脂酶D信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、黏液、氯烷烴和氯烯烴降解。因此，從整體觀察發(fā)現(xiàn)，辣椒抗疫病和感疫病差異基因主要集中于植物激素調(diào)節(jié)和蛋白調(diào)節(jié)等通路。將GO富集和KEGG富集結(jié)合起來(lái)分析發(fā)現(xiàn)，辣椒抗疫病和感疫病差異主要與酶類活性功能、逆境響應(yīng)過(guò)程相關(guān)，其次為結(jié)合蛋白代謝途徑、植物激素調(diào)節(jié)等過(guò)程。

表7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中差異基因的GO子類詳細(xì)分析和KEGG通路分析Tab.7 The detailed GO subcategory analysis and KEGG pathways for DEGs in the RNA-seq analysis

3 結(jié)論與討論

本研究利用114份辣椒自然群體通過(guò)人工灌根法接種辣椒疫病，通過(guò)對(duì)病情的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高抗材料較少，大多數(shù)材料都會(huì)感病，只是發(fā)病程度不一致。灌根法接種辣椒疫病這種方法理論上更符合大田病害發(fā)生實(shí)際侵染模式，基本上可模擬田間病害發(fā)生過(guò)程。

從篩選出的抗病和感病材料中選擇1份抗疫病材料L3和 3份感病材料L1、L2和L4進(jìn)行RNA-seq高通量測(cè)序分析。Illumina 高通量測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)量大，并且試驗(yàn)效率高，成本低，適合于辣椒疫病轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究。本研究共獲得了177 238 390條的reads，總堿基數(shù)為26.59 Gb，每個(gè)樣品均獲得6.2 Gb以上的堿基。有82.66%～89.99%的Clean數(shù)據(jù)比對(duì)到辣椒參考基因組上，并且有78.95%～85.11%的Clean數(shù)據(jù)比對(duì)到唯一的基因組位點(diǎn)，這一結(jié)果顯示，本研究高通量測(cè)序結(jié)果可靠，并且可以大量挖掘辣椒抗疫病過(guò)程中表達(dá)的重要基因。通過(guò)對(duì)辣椒抗病和感病的轉(zhuǎn)錄組比較分析，經(jīng)GO和KEGG差異基因功能顯著性富集分析，結(jié)果與前人研究辣椒疫病[12-15]、馬鈴薯疫病[16-19]等結(jié)果較一致。與辣椒疫病相關(guān)的基因功能主要表現(xiàn)為酶類、植物激素和泛素化等。通過(guò)抗病和感病成對(duì)比較L3/L1、L3/L2、L3/L4，結(jié)果顯示，3組樣本共同的差異基因331個(gè)，其中，68個(gè)上調(diào)基因，主要包含氧化還原酶活性、碳氧裂解酶活性、過(guò)氧化物酶活性、催化活性、代謝過(guò)程、蛋白酶負(fù)調(diào)節(jié)活性等相關(guān)基因；263個(gè)下調(diào)基因，主要包含氧化還原酶活性、氧化還原過(guò)程、逆境反應(yīng)、胞外區(qū)、防御反應(yīng)以及一些蛋白酶活性等相關(guān)基因。

過(guò)氧化物酶可以通過(guò)抑制真菌生長(zhǎng)、清除過(guò)氧化氫，從而達(dá)到保護(hù)植物組織免受細(xì)胞損傷的作用。Alczar等[20]發(fā)現(xiàn)，接種辣椒疫病后，辣椒體內(nèi)過(guò)氧化物酶活性均升高，尤其是高抗病品種中增加的幅度最大；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，只在抗病品種細(xì)胞間檢測(cè)出過(guò)氧化物酶，說(shuō)明在抗病品種中沿菌絲生長(zhǎng)方向的過(guò)氧化物酶阻止了菌絲的迅速蔓延。同時(shí)Mozzetti等[21]研究也指出，過(guò)氧化物酶活性與辣椒疫病病情嚴(yán)重度相關(guān)。與辣椒疫病相關(guān)的酶類還有很多，如多酚氧化酶，將酚類物質(zhì)氧化為醌類物質(zhì)，并且聚合其為單寧類物質(zhì)，這樣就可以迅速殺死疫病侵入點(diǎn)周圍的細(xì)胞，從而達(dá)到抑制病原發(fā)生的目的。蛋白酶類通過(guò)磷酸化和去磷酸化可逆過(guò)程作為細(xì)胞信號(hào)，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)答對(duì)環(huán)境的脅迫。

植物激素對(duì)辣椒疫病也有防御調(diào)控，主要有茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和水楊酸(SA)等[22-24]。其中，JA在植物抗病反應(yīng)中是重要的信號(hào)分子，可誘導(dǎo)多酚氧化酶、苯丙烯酰苯合成酶、過(guò)氧化氨酶等防御蛋白的合成[25-27]。JA不僅是一種植物激素，同時(shí)也是植物抗性誘導(dǎo)劑，噴施JA等激素可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，同時(shí)也能增加富含羥輔氨酸的糖蛋白的含量。也有人研究發(fā)現(xiàn)，JA能激活許多與植物防御相關(guān)的基因，如編碼抗真菌蛋白的植物防衛(wèi)素、硫素蛋白等合成的基因[28]。SA是植物免疫反應(yīng)中一個(gè)重要的信號(hào)分子，植物在受到病原菌侵染后，體內(nèi)SA含量顯著提高，可產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。ET途徑與JA途徑都可以調(diào)控?cái)M南芥中抗病防衛(wèi)基因PDF1.2的表達(dá)，具有協(xié)同作用，同時(shí)二者還可抑制SA的合成，均與SA途徑存在拮抗作用。

泛素化也是植物參與抗病反應(yīng)的途徑之一，由泛素激活酶、泛素結(jié)合酶和泛素連接酶共同完成，其中，泛素連接酶能特異性識(shí)別病原物效應(yīng)蛋白并使其降解，是泛素化在植物抗病研究中的熱門和關(guān)注對(duì)象[29-31]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域和組成的差異，泛素連接酶可分為HETC型、RING/U-BOX型、Cullin-RING型和APC/C型，其中，Cullin-RING型和RING/U-BOX型泛素連接酶在植物抗病中具有重要作用[32]。Cullin-RING型泛素連接酶可通過(guò)特異性降解水楊酸(SA)途徑中調(diào)控蛋白NPR1、TGA2、NIMIN1等來(lái)介導(dǎo)SA抗病信號(hào)途徑[33-34]。Cullin-RING型泛素連接酶亞基F-box蛋白COI1可以介導(dǎo)植物的茉莉酸(JA)抗病信號(hào)途徑的傳導(dǎo)，對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原物產(chǎn)生抗性[35]。編碼RING/U-BOX型泛素連接酶ATL基因在擬南芥、番茄和水稻中均發(fā)現(xiàn)，在免疫反應(yīng)中調(diào)控了對(duì)病原物的抗性[31]。一些具有泛素連接酶活性的U-BOX蛋白也已被證明具有調(diào)控植物細(xì)胞死亡、過(guò)氧化氫和茉莉酸含量，進(jìn)而影響植物免疫反應(yīng)的功能[36]。

辣椒對(duì)疫霉的免疫反應(yīng)是一個(gè)極其復(fù)雜、多途徑協(xié)同的過(guò)程，其中主要包括酶類活性調(diào)節(jié)、植物激素抗病信號(hào)途徑和泛素化。這些途徑在調(diào)控辣椒對(duì)病原物的抗性過(guò)程中除了行使其單一功能外，還互相影響參加其他途徑。說(shuō)明辣椒對(duì)疫病的抗性并不是由個(gè)別基因所控制，而是一個(gè)系統(tǒng)性調(diào)節(jié)機(jī)制，需要大量的功能基因參與其中，這與本研究的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相契合。

研究通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)辣椒抗疫病和感疫病2組材料進(jìn)行了比較深入的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，其結(jié)果可為在轉(zhuǎn)錄水平上全面了解辣椒抗疫病分子基礎(chǔ)提供有價(jià)值的參考。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，辣椒抗疫病是一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程，它由多個(gè)交叉通路調(diào)節(jié)，包括新陳代謝過(guò)程、酶活性調(diào)節(jié)、結(jié)合蛋白代謝、防御反應(yīng)及激素調(diào)節(jié)等，其結(jié)果為后期更深入研究辣椒抗疫病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。