歐陽清淵，梁金敏，王郁石，甘 翔，胡深強(qiáng)，王繼文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130)

食欲素(Orexin，OX)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)睡眠、覺醒、飲食行為、自主神經(jīng)等生理活動(dòng)上具有重要作用[1]。OX由食欲素前原(HCRT)基因編碼翻譯、水解得到，HCRT基因翻譯的前體食欲素蛋白(Prepro-orexin)產(chǎn)物水解后產(chǎn)生食欲素A(OXA)和食欲素B(OXB)2種多肽[2-3]。OX生物學(xué)功能的發(fā)揮主要依賴于食欲素受體1(HCRTR1)和食欲素受體2(HCRTR2)的介導(dǎo)作用，值得注意的是，HCRTR2是OXA和OXB的非選擇性受體。Yi等[4]研究顯示，食欲素能夠增加攝食，是機(jī)體能量平衡調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要物質(zhì)?；铙w和體外研究證實(shí)，食欲素對(duì)胰島素分泌具有急性刺激作用[5]。也有研究表明，腦室注射OXA 使胃酸、胰液分泌量持續(xù)顯著增加[6]。Tamura等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于切除卵巢的大鼠，食欲素可抑制黃體生成素(LH) 的波動(dòng)性分泌。Hoskins等[8]研究表明，食欲素和促性腺激素在金魚的繁殖過程中有系統(tǒng)協(xié)調(diào)控制現(xiàn)象。以上研究結(jié)果提示，作為下丘腦分泌的一種重要神經(jīng)肽，食欲素除在調(diào)節(jié)機(jī)體食欲和能量代謝平衡中起整合作用外，還可參與調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌、胃腸活動(dòng)等多種生理過程[9]。

前人研究表明，食欲素不僅存在于下丘腦而且廣泛分布于外周組織如腎上腺、腎臟等[10]。與此同時(shí)，食欲素受體主要在腦組織中表達(dá)，在部分外周組織如腎上腺、胃腸道和胰腺中也有表達(dá)。在人和鼠等哺乳動(dòng)物上都通過克隆得到HCRT和HCRTR2完整的編碼區(qū)序列[11-12]。在禽類上僅有原雞的HCRT和HCRTR2完整編碼區(qū)序列被克隆[13-14]，未見鵝的HCRT和HCRTR2基因序列報(bào)道。作為重要的家養(yǎng)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，鵝產(chǎn)蛋性能差制約著鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。鑒于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水禽課題組前期在產(chǎn)蛋和就巢鵝轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了食欲素基因表達(dá)量存在顯著差異，筆者推測其可能與鵝的產(chǎn)蛋性能相關(guān)。因此，本研究旨在克隆鵝HCRT和HCRTR2基因完整編碼區(qū)序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)檢測HCRT和HCRTR2在四川白鵝各組織中的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步探究食欲素及其受體基因在鵝繁殖活動(dòng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

采集3只處于產(chǎn)蛋期的四川白鵝母鵝大腦、嗅球、下丘腦、小腦、松果體、垂體、腎上腺、胰腺、食管、腺胃、肌胃、舌、小腸、輸卵管(峽部、傘部和膨大部)、子宮、陰道和卵巢組織，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。

1.2 RNA提取和cDNA制備

各樣本總RNA按照TRIzol(Invitrogen，USA)的操作說明書提取。用Bio-Rad核酸蛋白檢測儀測定濃度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆

根據(jù)NCBI上人(NM_001524)、原雞(NM_204185)和蜂鳥(XM_008505688)HCRT基因序列以及人(NM_001526)、原雞(NM_001024584)和綠頭鴨(XM_005009180)HCRTR2基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增獲得鵝HCRT和HCRTR2基因完整CDS區(qū)序列的特異性引物(表1)，引物送至深圳華大基因科技有限公司合成。

表1 RT-PCR引物信息Tab.1 Primer information of RT-PCR

采用10 μL反應(yīng)體系：上下游引物各0.4 μL，模板1 μL，Master Mix 5 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性：94 ℃ 3 min；變性：94 ℃ 30 s，退火：退火溫度見表1，30 s，延伸：72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，用膠回收試劑盒(TaKaRa)回收，回收產(chǎn)物連接pMD19-T(TaKaRa)載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。PCR檢測陽性克隆后，挑選陽性菌液送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用DNAman 軟件對(duì)克隆得到的片段進(jìn)行拼接得到目的基因序列。利用NCBI中ORFfinder程序查找目的基因的開放閱讀框，并使用NCBI中BlastN和Conserved Domains工具對(duì)目的基因序列翻譯的蛋白進(jìn)行相似性和保守功能區(qū)分析。利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域分析。利用Predict protein(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。利用Mega 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 RT-qPCR與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)已克隆得到的鵝HCRT和HCRTR2序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物(表2)，委托深圳華大基因科技有限公司合成。

表2 定量引物信息Tab.2 Quantitative primer information

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證引物的特異性。以各組織的cDNA 為模板，使用GAPDH和β-actin為內(nèi)參基因，采用SYBR Premix Ex Taq 為熒光染料，用Bio-Rad CFX 熒光定量PCR儀檢測HCRT和HCRTR2在四川白鵝各組織中的相對(duì)表達(dá)量，各個(gè)樣品重復(fù)3次。采用12.5 μL反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL，熒光標(biāo)記MIX 6.25 μL，cDNA模板4.25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性15 s，退火溫度(表2)30 s，40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后通過熔解曲線檢測PCR產(chǎn)物的特異性。運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，最后利用SPSS 20.0軟件中 One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，LSD 進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝HCRT基因生物信息學(xué)分析

克隆得到大小為456 bp的鵝HCRT基因，經(jīng)比對(duì)確定其覆蓋HCRT基因完整CDS區(qū)(圖1-A)，共編碼151個(gè)氨基酸。經(jīng)NCBI上Blast工具比對(duì)發(fā)現(xiàn)，鵝HCRT基因核苷酸和氨基酸序列與原雞、食魚鱷、鼠、人、爪蟾、斑馬魚的同源性分別為86%，77%，57%，63%，57%，54%和78%，70%，76%，64%，63%，39%。鵝HCRT基因翻譯產(chǎn)物(即食欲素前體肽)經(jīng)信號(hào)肽序列脫落和激素原轉(zhuǎn)化酶催化作用下裂解這2個(gè)步驟[1]，最終得到含34個(gè)氨基酸的鵝OXA和含28個(gè)氨基酸的鵝OXB。通過Predict protein軟件對(duì)OXA和OXB的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)OXA在Cys7-Cys13和Cys8-Cys15處存在2個(gè)二硫鍵，而OXB并未預(yù)測到二硫鍵的存在。利用SMART軟件對(duì)OXA和OXB的蛋白結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)OXA和OXB均存在1個(gè)包含其全部序列的Orexin super family結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。經(jīng)NCBI的Blast P進(jìn)行鵝HCRT基因各部分序列的同源性分析(表3)。結(jié)果表明，除斑馬魚外，OXA、OXB在不同物種中均非常保守，說明OXA和OXB在HCRT基因中扮演著重要的角色；但各物種間HCRT信號(hào)肽保守性較低，暗示其信號(hào)肽序列可能對(duì)于各物種的功能特性具有重要的意義。根據(jù)各物種HCRT氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)鵝的親緣關(guān)系與原雞最近，與斑馬魚最遠(yuǎn)。

A.鵝HCRT基因編碼區(qū)核苷酸序列和翻譯的氨基酸序列；B.鵝HCRT基因氨基酸序列比對(duì)及其結(jié)構(gòu)位置示意圖。圖中灰底區(qū)域?yàn)楦魑锓NOXA序列，黑底區(qū)域?yàn)楦魑锓NOXB序列，*為激素原轉(zhuǎn)化酶識(shí)別位點(diǎn)，“-”為與鵝完全一致序列，為了獲得最佳對(duì)齊而引入的間隙用“.”號(hào)表示。圖4同。

A.Nucleotide sequence and translated amino acid sequence in the coding region of gooseHCRTgene;B.Amino acid sequence comparison of gooseHCRTgene and its structural location. The gray bottom area in the figure is the OXA sequence of each species，the black bottom area is the OXB sequence of each species，* is the recognition site of hormone proto-invertase，"-" is the sequence completely consistent with goose，and the gap introduced for optimal alignment is denoted by ".".The same as Fig.4.

圖1 鵝HCRT基因編碼區(qū)序列及其結(jié)構(gòu)位置示意Fig.1 Sequence of HCRT gene coding region and its structural location in goose

圖2 HCRT系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HCRT

2.2 鵝HCRTR2基因生物信息學(xué)分析

將克隆得到的3段基因擴(kuò)增片段結(jié)果進(jìn)行拼接，得到鵝HCRTR2基因序列長1 666 bp(圖3)，含1個(gè)單一的ORF，長度為1 506 bp，編碼501個(gè)氨基酸。將獲得的鵝HCRTR2基因編碼區(qū)序列及其所翻譯的氨基酸序列，經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blast工具比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與原雞、食魚鱷、鼠、人、爪蟾、斑馬魚的同源性分別為94%，86%，80%，77%，74%，67%和95%，93%，88%，83%，82%，71%。利用SMART軟件對(duì)OX2R的蛋白結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)OX2R氨基酸序列第57-377位為7tmA_OXR結(jié)構(gòu)域，第389-436位為Orexin_rec2 super family結(jié)構(gòu)域(圖4)，表明OX2R、OXA和OXB的結(jié)合位點(diǎn)很可能位于結(jié)構(gòu)域Orexin receptor 2。TMHMM 2.0軟件分析OX2R蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)OX2R為7次跨膜蛋白。經(jīng)NCBI的BlastP進(jìn)行鵝HCRTR2各部分序列的同源性分析(表4)。結(jié)果表明，鵝HCRTR2的氨基酸序列與不同物種的同源性很高，表明其在生物體中具有很重要的作用。根據(jù)各物種HCRTR2基因翻譯的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，仍然是鵝與雞親緣關(guān)系最近，爬行動(dòng)物和哺乳動(dòng)物次之，魚類最遠(yuǎn)，與HCRT進(jìn)化相一致。

圖3 鵝HCRTR2基因編碼區(qū)核苷酸及氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and amino acid sequences in the coding region of goose HCRTR2 gene

灰底為7tmA_OXR結(jié)構(gòu)域，黑底為Orexin_rec2 super family結(jié)構(gòu)域。Gray background is 7tmA_OXR domain，black background is Orexin_rec2 super family domain.

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圖5 HCRTR2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of HCRTR2 gene

A.HCRT mRNA在四川白鵝各組織中的相對(duì)表達(dá)量；B.HCRTR2 mRNA在四川白鵝各組織中的相對(duì)表達(dá)量。同組數(shù)據(jù)上所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。A.Relative expression of HCRT mRNA in tissues of Sichuan White Goose;B.Relative expression of HCRTR2 mRNA in various tissues of Sichuan White Goose.Different letters in the same group mean significant difference (P<0.05)，while the same letters mean insignificant difference (P>0.05).

2.3 鵝HCRT和HCRTR2 mRNA組織表達(dá)分析

RT-qPCR結(jié)果(圖6)顯示，HCRTmRNA在四川白鵝19個(gè)組織中均有表達(dá)(圖6-A)，且在下丘腦和胰腺中的表達(dá)量顯著(P<0.05)高于除松果體和子宮外的剩余組織，包括大腦、嗅球、小腦、垂體、腎上腺、食管、腺胃、肌胃、舌、小腸、輸卵管峽部、輸卵管傘部、輸卵管膨大部、陰道和卵巢。鵝HCRTR2mRNA在下丘腦中的表達(dá)顯著高于(P<0.05)其他組織，且在垂體和性腺組織(卵巢、子宮、陰道、輸卵管峽部、輸卵管傘部、輸卵管膨大部)中均有表達(dá)(圖6-B)。因此，推測食欲素系統(tǒng)可能主要通過下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)參與鵝生殖生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)成功克隆得到鵝HCRT和HCRTR2基因全長CDS區(qū)序列，長度分別為456，1 506 bp，各自編碼151，501個(gè)氨基酸。TMHMM 2.0分析發(fā)現(xiàn)，HCRTR2基因編碼的蛋白為7次跨膜蛋白，且極有可能位于胞膜，這與前人文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[15]，即禽類中的HCRTR2與哺乳動(dòng)物一樣，也是位于胞膜的G蛋白偶聯(lián)受體。

OXA與OXB是食欲素重要的功能執(zhí)行單位[15]。通過分析發(fā)現(xiàn)，鵝OXA具有2個(gè)二硫鍵而OXB序列不具有二硫鍵，說明OXB有較小的替代作用；通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)OXA和OXB在物種間具有高度的保守性，這也輔證了OXA、OXB所承擔(dān)的重要生物學(xué)功能。HCRTR2基因在各物種間高度保守，但其所含結(jié)構(gòu)域序列在禽類與哺乳類動(dòng)物之間卻存在著較大的差異。此種差異可能與禽類和哺乳動(dòng)物之間的進(jìn)食習(xí)慣與節(jié)律差異有關(guān)，推測其可能與對(duì)應(yīng)的HCRTR2的功能特性有密切的聯(lián)系，是體現(xiàn)HCRTR2種屬間功能差異的關(guān)鍵區(qū)段。這也從側(cè)面說明了鵝，乃至禽類的HCRTR2可能對(duì)其食欲素作用有相對(duì)獨(dú)特的意義。

RT-qPCR結(jié)果顯示，鵝HCRTmRNA除了在下丘腦表達(dá)外在其他外周組織中也均有表達(dá)，這與在鼠和人中的研究一致[10,16]。鵝HCRTmRNA在下丘腦和胰腺中的表達(dá)量顯著(P<0.05)高于大腦和嗅球等15個(gè)組織，但不顯著高于松果體和子宮。鵝HCRTR2mRNA在下丘腦中的表達(dá)顯著(P<0.05)高于其他組織，在胰腺和腎上腺2個(gè)內(nèi)分泌組織中的表達(dá)量僅次于下丘腦，在腦部組織、繁殖器官及消化器官中均有不同程度的表達(dá)。HCRT及HCRTR2mRNA均在下丘腦表達(dá)最高，且均在垂體及性腺組織(卵巢、子宮、陰道、輸卵管峽部、輸卵管傘部、輸卵管膨大部)中有表達(dá)，提示食欲素系統(tǒng)可能通過下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)參與動(dòng)物生殖機(jī)能的調(diào)節(jié)[17]。同時(shí)，食欲素系統(tǒng)可能還參與了應(yīng)激對(duì)繁殖功能的調(diào)控，HCRT能促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素[18]，這與本研究在HCRT和HCRTR2mRNA中檢測到腎上腺的表達(dá)相一致。此外，光照長短能調(diào)節(jié)松果體中褪黑激素的分泌，而褪黑激素正是可以通過G 蛋白偶聯(lián)受體途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)繁殖功能的調(diào)控[19]。本研究中HCRT和HCRTR2mRNA在松果體中均有表達(dá)這一結(jié)果，提示食欲素系統(tǒng)可能與鵝的季節(jié)性繁殖有關(guān)。

綜上，本試驗(yàn)克隆得到了鵝HCRT和HCRTR2基因完整CDS區(qū)序列，分別為456，1 506 bp，各自編碼151，501個(gè)氨基酸。RT-qPCR結(jié)果顯示，HCRT和HCRTR2基因在鵝下丘腦中表達(dá)量達(dá)到最高，在其他組織中也有不同程度的表達(dá)，提示食欲素系統(tǒng)可能通過下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)參與動(dòng)物生殖機(jī)能的調(diào)節(jié)。以上研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明HCRT和HCRTR2基因在鵝繁殖活動(dòng)中的作用及其分子機(jī)制。