適用于蛋白質(zhì)組分析的粉紅單端 孢菌蛋白提取方法的建立

王 鵬，王軍節(jié)，李貞彪

(北方民族大學 生物科學與工程學院，植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)屬于半知菌門聚單孢屬的一種世界性且危害嚴重的植物病原真菌[1]。該菌分生孢子在頂端側(cè)生，單孢倒梨形且無色，頂部有偏乳頭狀突起，常聚生，成熟孢子中間有隔膜，分隔處稍縊縮；其產(chǎn)孢量大，分生孢子梗直立、無分枝、無色、無隔，菌落近似圓形，初為白色絨毛狀或粉狀，后變?yōu)榉奂t色，背面呈淺橙紅色[2]。該菌不僅能侵染玉米[3]、向日葵[4]、銀杏樹干[5]、中國槭樹干[6]、無患子樹干[7]、中國玉竹[8]等植物，還可造成蘋果[9-11]、石果[12]、甜瓜[13-15]、梨[16]、葡萄[17-18]、番茄[19-21]、黃瓜[21]、菜豆[22]和辣椒[23]等果蔬發(fā)生嚴重真菌病害及生物污染。粉紅單端孢侵染過程還可產(chǎn)生粉紅單端孢毒素給人類帶來安全隱患[24]。因此，研究控制粉紅單端孢的病害具有重要意義，而全面解釋病菌的分子致病機理是有效控制其病害的前提。目前，已有研究人員從毒素[25]和其他代謝產(chǎn)物[26]水平對該菌致病機制開展了初步研究，但從蛋白質(zhì)組水平揭示粉紅單端孢分子致病機制的研究尚未見報道。

目前，蛋白質(zhì)組學作為一種研究病原真菌致病機制的重要手段已被廣泛應用。雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中一種有效的蛋白質(zhì)分離方法，而獲得高分辨率2-DE圖譜的關(guān)鍵步驟是蛋白質(zhì)提取[27]。適用于2-DE技術(shù)的植物病原真菌總蛋白提取的常用TCA/丙酮[28]、酚抽提[29]及其衍生的改良方法。江珊等[30]采用改進的TCA/丙酮法對稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)菌絲體蛋白質(zhì)進行雙向電泳分析，獲得了高分辨率電泳圖譜。Fernández-Acero等[31]研究了磷酸鹽緩沖液預處理對TCA-丙酮法提取灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌絲體總蛋白的效果，發(fā)現(xiàn)在TCA/丙酮沉淀蛋白質(zhì)樣品之前使用磷酸鹽緩沖液進行預處理可顯著提高灰葡萄孢菌絲體總蛋白的提取效果。González等[32]研究發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮結(jié)合苯酚提取法所提取的灰葡萄孢菌絲體蛋白含量高于磷酸-TCA-丙酮法，且該方法提高了蛋白點的分辨率，減少拖尾，有更多的蛋白點被檢測出。舒燦偉等[33]對采用不同蛋白質(zhì)提取方法所提取的水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量進行比較研究，結(jié)果表明，優(yōu)化的TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法適用于水稻紋枯病菌蛋白質(zhì)雙向電泳的提取。然而，有關(guān)粉紅單端孢蛋白質(zhì)的有效提取方法研究鮮有報道。

本研究采用超聲-TCA-丙酮、超聲-磷酸-TCA-丙酮、超聲-SDS、超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提和TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提等方法提取粉紅單端孢總蛋白，從蛋白質(zhì)含量、濃度和電泳分辨率三方面比較了不同提取方法的提取效果，對較理想的2種方法進行雙向電泳對比分析，旨在探索出一套適合于雙向電泳分析的粉紅單端孢總蛋白的提取方法，以期為粉紅單端孢的蛋白質(zhì)組學研究提供技術(shù)支撐，進而為該菌致病機制的揭示以及病害控制等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株分離自發(fā)病甜瓜果實，通過分子生物學鑒定為粉紅單端孢，由北方民族大學植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

甲叉雙丙烯酰胺、硫酸銨、丙烯酰胺、溴酚藍、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、TRIS、低熔點瓊脂糖、甘油、礦物油、尿素、硫脲、碘代乙酰胺和β-巰基乙醇均購自Amresco；十二烷基硫酸鈉、DTT和SDS購自Biotopped；甘氨酸購自Sigma；Tris飽和酚購自Solarbio；氯乙酸、磷酸、丙酮、甲醇和冰乙酸均購自天津市大茂化學試劑廠。

BMJ-800C霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、SW-CJ-1FD雙垂直無菌工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、H2100R冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)、UV-9000S紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)、YXQ-LS-50A高壓滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、DYCZ-24DN迷你電泳儀(北京市六一儀器廠)、PROTEAN IEFSytem(BIO RAD)、PROTEAN Ⅱ XL Cell(BIO RAD)、721BRO3006 UV凝膠成像系統(tǒng)(BIO RAD)和GS-800彩色掃描儀(BIO RAD)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌培養(yǎng)與收集 將粉紅單端孢接種于PDA平板上，置于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后。無菌條件下，每包用鑰匙刮取菌體2 g，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 菌體總蛋白的提取 超聲-TCA-丙酮法[34]。取2 g凍干的菌體與4 g石英砂混合，加液氮研磨成粉末后轉(zhuǎn)入50 mL離心管，立即加入30 mL預冷的10% TCA-丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)，渦旋混勻，除去石英砂；4 ℃、53 kHz超聲波3～5 min，-20 ℃過夜。將混合物在4 ℃、12 000 r/min離心20 min后棄上清，加入30 mL丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)重懸沉淀后在-20 ℃靜置1 h。重復洗滌4次；最后一次棄上清，將沉淀敞口置于通風櫥內(nèi)，使沉淀中殘留的丙酮揮發(fā)干凈，獲得蛋白質(zhì)干粉-20 ℃保存。

超聲-磷酸-TCA-丙酮法[35]。取2 g凍干的菌體與4 g石英砂混合，加液氮研磨成粉末后轉(zhuǎn)入50 mL離心管，立即加入30 mL預冷的10 mmol/L磷酸鉀-磷酸緩沖液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇，pH值7.4)，渦旋混勻，除去石英砂；4 ℃、53 kHz超聲波3～5 min，4 ℃靜置2 h。將混合物在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清，加入30 mL預冷的10% TCA-丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)，渦旋混勻，-20 ℃靜置過夜。4 ℃、12 000 r/min離心20 min后棄上清，加入30 mL丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)重懸沉淀后在-20 ℃靜置1 h。重復洗滌4次；最后一次棄上清，將沉淀敞口置于通風櫥內(nèi)，使沉淀中殘留的丙酮揮發(fā)干凈，獲得蛋白質(zhì)干粉-20 ℃保存。

超聲-SDS法[36]。取2 g凍干的菌體與4 g石英砂混合，液氮充分研磨至粉末后轉(zhuǎn)入50 mL離心管，立即加入30 mL SDS緩沖溶液(30%甘油、4%SDS、5% β-巰基乙醇、Tris-HCl(0.1 mol/L，pH值6.8)，V/V)，充分混勻，除去石英砂；4 ℃、53 kHz超聲波3～5 min，80 ℃下水浴加熱5 min后在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄沉淀；在上清液中加入4倍體積預冷丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)，渦旋混勻后-20 ℃過夜。將混合物在4 ℃、12 000 r/min離心20 min獲得沉淀，用預冷的丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)洗滌沉淀1次，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。將沉淀敞口置于通風櫥內(nèi)，使沉淀中殘留的丙酮揮發(fā)干凈，獲得蛋白質(zhì)干粉-20 ℃保存。

超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法[37]。取2 g凍干的菌體與4 g石英砂混合，液氮充分研磨至粉末后轉(zhuǎn)入50 mL離心管，立即加入30 mL預冷的10% TCA-丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)，渦旋混勻，除去石英砂。4 ℃、53 kHz超聲波3～5 min，-20 ℃過夜。將混合物在4 ℃、12 000 r/min離心20 min后棄上清，用80%甲醇溶液(含100 mmol/L的醋酸銨)和80%丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)各洗滌沉淀1次，在通風櫥內(nèi)干燥10 min。再加入10 mL SDS/酚抽提液(Tris飽和酚(pH值7.8)：30% 甘油、4% SDS、5% 巰基還原劑、Tris-HCl(0.1 mol/L，pH值6.8)，V/V)，振蕩混勻溫育5 min。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上層酚相至新離心管中，加入5倍體積預冷的80%甲醇溶液(含100 mmol/L的醋酸銨)，-20 ℃過夜。將混合物在4 ℃、12 000 r/min離心20 min獲得蛋白質(zhì)沉淀，用80%甲醇溶液(含100 mmol/L的醋酸銨)和80%丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)各洗滌沉淀1次，4 ℃、12 000 r/min、20 min離心，將沉淀敞口置于通風櫥內(nèi)，使沉淀中殘留的丙酮揮發(fā)干凈，獲得蛋白質(zhì)干粉-20 ℃保存。

TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法[37]。取2 g凍干的菌體與4 g石英砂混合，液氮充分研磨至粉末后轉(zhuǎn)入50 mL離心管，立即加入30 mL預冷的10% TCA-丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)，渦旋混勻，除去石英砂，-20 ℃過夜。將混合物在4 ℃、12 000 r/min離心20 min后棄上清，用80%甲醇溶液(含100 mmol/L的醋酸銨)和80%丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)各洗滌沉淀1次，在通風櫥內(nèi)干燥10 min。再加入10 mL SDS/酚抽提液(Tris飽和酚(pH值7.8)：30% 甘油、4% SDS、5% 巰基還原劑、Tris-HCl(0.1 mol/L，pH值 6.8)，V/V)，振蕩混勻溫育5 min。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上層酚相至新離心管中，加入5倍體積預冷的80%甲醇溶液(含100 mmol/L的醋酸銨)，-20 ℃過夜。將混合物在4 ℃、12 000 r/min離心20 min獲得蛋白質(zhì)沉淀，用80%甲醇溶液(含100 mmol/L的醋酸銨)和80%丙酮溶液(含0.07%V/Vβ-巰基乙醇)各洗滌沉淀1次，4 ℃、12 000 r/min、20 min離心，將沉淀敞口置于通風櫥內(nèi)，使沉淀中殘留的丙酮揮發(fā)干凈，獲得蛋白質(zhì)干粉-20 ℃保存。

1.3.3 蛋白質(zhì)溶解及定量分析 蛋白質(zhì)溶解參考Choi和Shim[38]方法，分別取上述5種方法獲得的蛋白質(zhì)樣品，稱取0.1 g蛋白質(zhì)干粉加入1 mL裂解液(8.0 mol/L尿素、2.0 mol/L硫脲、4%m/VCHAPS、1%m/VDTT、0.5%V/VBio-lyte 4-7和Bio-lyte 3-10)中室溫進行裂解3～4 h，每隔30 min輕輕搖勻1次，4 ℃、12 000 r/min離心20 min取上清液。樣品可在-80 ℃下保存或直接電泳。蛋白質(zhì)定量采用Bradford法[39]，牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白，考馬斯亮藍G-250染色，標準曲線方程為Y=7.948 6X+0.015 9，R2=0.997 8，結(jié)果分別用mg/mL和mg/g表示。

1.3.4 SDS-PAGE分析 取5種方法提取的蛋白質(zhì)溶液各100 μL分別與100 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，100 ℃水浴加熱3～5 min，冷卻后4 ℃、12 000 r/min、1 min離心備用。先任選一種方法，參考趙玲玲等[40]方法，采用30 μg等體積上樣，設(shè)計9%，12%，15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳分析，選擇適合于粉紅單端孢菌電泳的聚丙烯酰胺凝膠濃度，其不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠配制如表1所示。電泳結(jié)束，用考馬斯亮藍染液(甲醇45 mL、超純水45 mL、冰乙酸10 mL、溶解0.25 g的考馬斯亮藍R-250)在水平搖床上慢速水平搖動染色0.5～1 h，再用脫色液(250 mL甲醇、80 mL冰乙酸、超純水定容至1 000 mL)脫色4～8 h，期間更換脫色液3～4次，脫色至膠體的藍色背景褪去，能看到明顯的條帶，用UV凝膠成像系統(tǒng)拍照后分析結(jié)果。

表1 不同濃度聚丙烯酰胺凝膠的配制Tab.1 Preparation of different concentrations of polyacrylamide gels

1.3.5 雙向電泳分析[41-42]從5種粉紅單端孢菌體蛋白質(zhì)提取方法中選取2種提取方法較好的蛋白質(zhì)，第一向等電聚焦使用長度為17 cm、pH值3～10非線型膠條，根據(jù)測定的蛋白質(zhì)濃度上樣量400 μg，上樣總體積350 μL的水化上樣方式進行等電聚焦。第二向用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，獲得蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜并分析結(jié)果。

1.3.6 凝膠染色及圖像處理 用考馬斯亮藍染液(甲醇45 mL、超純水45 mL、冰乙酸10 mL、溶解0.25 g、考馬斯亮藍R-250)染色4 h以上或過夜后，先用脫色液Ⅰ(V甲醇∶V超純水∶V冰乙酸=9∶9∶2)脫色30 min，再脫色液Ⅱ(V乙醇∶V超純水∶V冰乙酸=9∶9∶2)脫色4～8 h，期間更換脫色液Ⅱ 3～4次，直到凝膠背景干凈。用GS-800 Calibrated Imaging Densitometer(BIO-RAD)型凝膠掃描儀掃描，并用PDQuantity One軟件進行圖片分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析 所有試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0、IBM SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析與作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)提取效果的比較

不同提取方法對粉紅單端孢菌蛋白質(zhì)濃度和含量的影響如圖1所示。由圖1可知，不同提取方法均能獲得菌體蛋白，但獲得蛋白質(zhì)的濃度和含量差異顯著；如圖1，濃度從高到低依次為超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法、TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法、超聲-SDS法、超聲-TCA-丙酮法和超聲-磷酸-TCA-丙酮法，分別為6.650，6.221，2.777，2.676，1.219 mg/mL，超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法獲得的蛋白質(zhì)濃度顯著高于其他方法，為6.650 mg/mL；超聲-SDS法獲得的蛋白質(zhì)含量最低，為1.111 mg/g，而超聲-磷酸-TCA-丙酮法、TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法、超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法、超聲-TCA-丙酮法分別比超聲-SDS法獲得的蛋白含量高1.8，2.5，2.7，4.1倍，超聲-TCA-丙酮法獲得的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他方法，為2.993 mg/g(圖1)。

Ⅰ.超聲-TCA-丙酮法； Ⅱ.超聲-磷酸-TCA-丙酮法；Ⅲ.超聲-SDS法；Ⅳ.超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法; Ⅴ.TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法。圖3同。

Ⅰ.Ultrasound-TCA-acetone method; Ⅱ.Ultrasound-phosphoric acid-TCA-acetone method; Ⅲ.Ultrasound-SDS method; Ⅳ.Ultrasonic-TCA/acetone-phenol/SDS combined extraction; Ⅴ.TCA/acetone-phenol/SDS combined extraction.The same as Fig.3.

圖1 不同菌體蛋白提取方法對質(zhì)量濃度及含量的影響
Fig.1 Effect of different methods of bacterial proteinextraction on concentration and content

2.2 聚丙烯酰胺凝膠濃度的比較

不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)電泳圖譜的影響如圖2所示，不同濃度的聚丙烯酰胺均在不同程度上影響電泳圖譜的分辨率，獲得的電泳圖譜存在差異；9%的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜分離得到的蛋白質(zhì)Marker和超聲-TCA-丙酮法獲得的蛋白質(zhì)樣品分別有9，15條帶，條帶清晰，但不能分離出小分子蛋白，使電泳尾部有大量的蛋白分子堆積現(xiàn)象；12%的聚丙烯酰胺凝膠獲得的電泳圖譜背景色較淺、條帶清晰可見、條帶分布均勻，分離得到的蛋白質(zhì)Marker和超聲-TCA-丙酮法獲得的蛋白質(zhì)樣品分別有10，21條帶；15%的聚丙烯酰胺凝膠獲得的電泳圖譜背景色較深、條帶不清晰，分離得到的蛋白質(zhì)Marker和超聲-TCA-丙酮法獲得的蛋白質(zhì)樣品分別有10，16條帶，并且不能將大分子蛋白分離開。因此，濃度為9%和15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜分辨率較低，不適合于粉紅單端孢菌的蛋白質(zhì)電泳，而濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜分辨率較高，適合于該菌的蛋白質(zhì)電泳。

M.蛋白質(zhì)Marker；Ⅰ.超聲-TCA-丙酮法。M.Protein Marker; I.Ultrasound-TCA-acetone method.

2.3 SDS-PAGE分離效果的比較

不同提取方法獲得的粉紅單端孢菌電泳圖譜如圖3所示。不同提取方法均能獲得菌體蛋白，且蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量多集中在40～170 ku，但不同方法所獲得的蛋白在凝膠電泳中的條帶數(shù)目及清晰度均存在差異；超聲-TCA-丙酮法、超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法和TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法所得樣品電泳條帶數(shù)目最多、最清晰、分離效果較好，說明這3種方法提取的蛋白質(zhì)純度高、污染少；超聲-磷酸-TCA-丙酮法條帶也多，但清晰度低，背景模糊，說明含有較多雜質(zhì)；超聲-SDS法幾乎無條帶，其蛋白質(zhì)分子都聚集于末端，說明獲得的蛋白質(zhì)被降解為小分子肽鏈。因此，從單向SDS-PAGE的比較結(jié)果可以看出，超聲-TCA-丙酮法、超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法和TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法效果較好。

圖3 不同方法提取菌總蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE profiles of total proteins extracted by different methods

2.4 雙向電泳分析

超聲-TCA-丙酮法和超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提獲取的粉紅單端孢菌蛋白質(zhì)，分別進行雙向電泳得到的電泳圖譜如圖4所示。本次試驗除了提取方法不同，其他試驗條件完全一致。由圖4可知，超聲-TCA-丙酮法和超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法均獲得道了適合于雙向電泳的蛋白質(zhì)，但不同提取方法獲得的蛋白質(zhì)存在差異；超聲-TCA-丙酮法得到的電泳圖譜有642個蛋白質(zhì)點，并且凝膠背景顏色較深、背景模糊、有許多縱條紋和橫條紋，蛋白質(zhì)點也有嚴重的拖尾現(xiàn)象；超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法得到的電泳圖譜有1 238個蛋白質(zhì)點，凝膠背景干凈、清晰、橫條紋和縱條紋較少，也無嚴重的拖尾現(xiàn)象。根據(jù)超聲-TCA-丙酮法和超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法提取的2種蛋白質(zhì)粉末的顏色可知，超聲-TCA-丙酮法獲得的蛋白質(zhì)粉末較多，帶有淡淡的粉紅色，而超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法得到的蛋白質(zhì)粉末雖然少，但是粉末為純白色干粉。通過雙向電泳圖譜分析可知，超聲-TCA-丙酮法獲得的圖譜背景顏色含糊不清，有拖尾現(xiàn)象，說明蛋白質(zhì)中可能有大量的色素等雜質(zhì)是造成此現(xiàn)象的主要原因。因此，超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法提取的粉紅單端孢菌體蛋白質(zhì)適合于該菌雙向電泳體系，后續(xù)有關(guān)粉紅單端孢菌蛋白質(zhì)組學的研究將采用超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法進行。

A.超聲-TCA-丙酮法；B.超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法。A.Ultrasonic-TCA-acetone method; B.Ultrasonic-TCA/acetone-phenol/SDS combined extraction method.

3 結(jié)論與討論

不同蛋白質(zhì)的提取方法直接影響蛋白質(zhì)的提取效果，且不同材料的蛋白質(zhì)提取存在較大差異[43]。研究結(jié)果表明，超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法獲得的粉紅單端孢菌的蛋白質(zhì)量顯著高于TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提法。與液氮研磨的TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提方法相比，超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提方法增加了超聲破碎過程，超聲能給予液氮研磨后的二次破碎，增加了材料的破碎力度，能較好獲得真菌菌絲和孢子體細胞壁上與多糖、幾丁質(zhì)等物質(zhì)緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)。因此，超聲破碎結(jié)合液氮研磨的雙重物理破碎是一種理想的病原真菌蛋白質(zhì)提取途徑。研究結(jié)果還表明，在超聲-TCA-丙酮、超聲-磷酸-TCA-丙酮、超聲-SDS和超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提等4種雙重物理破碎方法中，超聲-TCA-丙酮和超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提效果較好。超聲-TCA-丙酮為經(jīng)典的蛋白質(zhì)提取方法，其操作簡單并能降低次生代謝物干擾、減少蛋白降解、消除蛋白質(zhì)水解和其他蛋白酶修飾[44-45]。與超聲-TCA-丙酮不同，超聲-磷酸-TCA-丙酮法中磷酸處理可適當去除一些雜質(zhì)，但該處理也會導致高分子質(zhì)量蛋白的缺失。該研究結(jié)果與Elakhal等[34]和張小泉[35]的研究不相符，可能由于研究材料的不同所致。超聲-SDS提取中加熱過程可使蛋白降解為小分子物質(zhì)而影響提取效果，該結(jié)果與舒燦偉等[33]研究結(jié)果不一致，可能是因為不同樣品的蛋白質(zhì)對溫度的承受度不同所致。

進一步采用雙向電泳分析表明，超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提獲得的蛋白質(zhì)質(zhì)量明顯高于超聲-TCA-丙酮法，且能分離出更多的酸性蛋白。本研究結(jié)果與舒燦偉等[33]和馮浩等[37]的研究結(jié)果一致。這可能是在超聲-TCA-丙酮法基礎(chǔ)上，增加酚/SDS抽提步驟能溶解更多蛋白以及高效去除核酸、小分子物質(zhì)等雜質(zhì)。SDS是一種表面活性劑，能有效溶解蛋白質(zhì)；酚抽提可大大增加蛋白的溶解性，同時能很好去除樣品中鹽離子、多糖、脂類、色素等雜質(zhì)，被廣泛應用于含較多干擾物材料的蛋白質(zhì)提取[29]。Wang等[46]將TCA/丙酮沉淀和苯酚提取聯(lián)合使用，綜合了TCA-丙酮沉淀法和酚法的優(yōu)點，其結(jié)果表明，酚/SDS聯(lián)合抽提法比酚、SDS緩沖液單獨提取的效果更好。Fernández-Acero等[36]的試驗結(jié)果也表明，TCA/丙酮沉淀法和苯酚提取法的聯(lián)合使用可以更好地提高蛋白質(zhì)純度。

由此可見，超聲-TCA/丙酮-酚/SDS聯(lián)合抽提是一種適用于粉紅單端孢菌的蛋白質(zhì)雙向電泳提取方法。此外，iTRAQ技術(shù)作為一種新的、功能強大的比較質(zhì)白質(zhì)組學技術(shù)，具有高通量、重復性好、能夠處理復雜樣本等優(yōu)點，其在真菌研究的應用價值中已得到初步驗證[47]。但iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中的所有蛋白結(jié)合，容易受樣本中的雜質(zhì)蛋白及樣本處理過程中緩沖液的污染等缺點也制約了該技術(shù)的應用，需要對樣本進行預處理并盡量減少操作過程中的污染[48]。由此表明，超聲-TCA/丙酮法-酚/SDS抽提法可以高效的去除蛋白樣品中的雜質(zhì)，得到較高純度及豐度的蛋白質(zhì)，有望在iTRAQ技術(shù)中得到廣泛的應用。