超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑殘留量

李垚辛

摘 要：本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉中兩種硝基咪唑代謝產(chǎn)物——羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷除脂，Retain-CX固相萃取柱凈化，以0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相梯度洗脫，C18色譜柱分離，正離子模式電噴霧電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）測定雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑含量。在5.0～200ng/mL范圍內(nèi)，兩種代謝物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.997，檢出限為0.13～0.16μg/kg，定量限為0.43～0.53μg/kg，在1.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg這3個加標(biāo)濃度下的回收率為76.0%～109.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～14.5%（n=6）。這說明，該方法準(zhǔn)確、高效，適用于雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的檢測。

關(guān)鍵詞：雞肉 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 固相萃取 羥基甲硝唑 羥甲基甲硝咪唑

1 引言

硝基咪唑類藥物是一類應(yīng)用廣泛的人工合成的具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)的化合物，常用藥物主要有甲硝唑、地美硝唑和洛硝噠唑等。此類藥物能殺滅和預(yù)防厭氧菌及病原蟲，可用于治療與預(yù)防家禽的滴蟲病、球蟲病、豬密螺旋體性痢疾及動物的各種厭氧菌感染[1]。由于硝基咪唑類藥物含有的硝基雜環(huán)類化合物存在細(xì)胞誘變性，因此具有潛在的動物致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，其藥物殘留對動物源性食品安全構(gòu)成了直接威脅，故被許多國家列為違禁藥物[2]。我國農(nóng)業(yè)部235號公告明確規(guī)定，甲硝唑和地美硝唑允許用作治療藥物，但不得在動物性食品中檢出；洛硝達(dá)唑禁止使用且不得在動物性食品中檢出[3]。羥基甲硝唑（MNZOH）是甲硝唑（Metronidazole）的代謝產(chǎn)物，羥甲基甲硝咪唑（HMMNI）是地美硝唑（Dimetridazole）和洛硝達(dá)唑（Ronidazole）的代謝產(chǎn)物。建立以上兩種硝基咪唑代謝物的分析方法對于防控動物源性食品安全風(fēng)險，監(jiān)測硝基咪唑類藥物使用及殘留情況具有重要意義。

目前，關(guān)于硝基咪唑類藥物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[4]、高效液相色譜法[5-6]、氣相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜-質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[9-12]等。雖然我國制定了一些相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)[14-16]，但大部分方法的檢測限相對較高，且主要針對硝基咪唑類原藥，對于其代謝物的檢測研究較少。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/ MS），分別對液相條件和質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，建立了雞肉中羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的檢測方法，以期為實驗室日常檢測和監(jiān)管硝基咪唑類藥物在食品中的濫用提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1290液相色譜、6420三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；ML203/02分析天平（0.001g），上海Mettler Toledo公司；XS205DU分析天平（0.01mg），上海Mettler Toledo公司；固相萃取小柱（HYPERSEP RETAIN-CX，60mg/3mL），美國Thermo公司；均質(zhì)機，中國?？乒?；離心機，德國Eppendorf公司。

試劑：甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨（色譜純），美國Thermo公司；羥基甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr公司；羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國WITEGA公司；實驗室用水為Milli-Q超純水。

產(chǎn)品：市售雞肉。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品前處理

稱取均質(zhì)試樣5g（精確到0.01g）置于50mL離心管中，加入5mL飽和氯化鈉溶液和15mL乙腈，均質(zhì)提取1min，4000r/min離心5min。然后，將上清液轉(zhuǎn)移至100mL雞心瓶中，再用15mL乙腈重復(fù)提取殘渣兩次。合并上清液至同一雞心瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5mL0.1%甲酸水溶液和5mL正己烷，混勻離心后，棄去正己烷層，待凈化。

Retain-CX固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水、3mL0.1%甲酸水活化，將待凈化液以1～2mL/min的速度過柱，用3mL0.1%甲酸水、3mL甲醇淋洗小柱，最后用3mL5%氨水甲醇分兩次洗脫，收集洗脫液于40℃氮氣下吹干，用1mL初始流動相溶解殘渣，過0.22μm濾膜，待上機。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱取6份空白樣品，按最終定容濃度5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，余下按樣品處理步驟制備基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列。

2.2.3 儀器條件

2.2.3.1 液相條件

安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B；流速：0.3mL/min；進樣體積：10μL；柱溫：40℃；洗脫程序：30%B（0～0.5min），30%～90%B（0.5～3min），90%B（3～7min）。

2.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：10L/min；霧化氣壓力：40psi；毛細(xì)管電壓：4000V；目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍、檢出限和定量限

將基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y建立線性回歸方程，結(jié)果表明，羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑濃度在5～100ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.997。

用標(biāo)準(zhǔn)系列第1點測得信噪比，結(jié)果見圖1、圖2。以信噪比（S/N）=3時的含量定為方法的檢出限（LOD），以信噪比（S/N）=10時的含量定為方法的定量下限（LOQ），結(jié)果見表2。

3.2 回收率與精密度

稱取空白樣品，添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為1.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg，每個水平做6個平行，得到回收率和精密度，結(jié)果見表3。羥基甲硝唑的回收率為76.0%～109.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.6%～14.5%；羥甲基甲硝咪唑的回收率為78.2%～105.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.7%～9.0%。

3.3 實際樣品分析

采購了不同地點的10份市售雞肉樣品進行檢測，均未檢出羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑這兩種硝基咪唑類代謝物。

4 結(jié)論

本文采用乙腈提取，正己烷脫脂，固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，建立了雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑殘留的分析方法。該方法操作簡便，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，適用于實驗室日常檢測，也為硝基咪唑類藥物監(jiān)測提供了技術(shù)支撐。

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