液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測嬰幼兒乳粉中的丙烯酰胺

于曉瑾，王浩，張杉，張旭，陳江龍

（北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心（北京市食品檢驗所），國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100094）

0 引 言

嬰幼兒配方乳粉是可以替代母乳為嬰兒提供合理營養(yǎng)素的配方食品，產(chǎn)品的質(zhì)量和安全直接關(guān)系到以此為全部或大部分營養(yǎng)來源的嬰幼兒的健康和生長發(fā)育。前些年，我國層出的嬰幼兒食品安全事件反映出我國嬰幼兒配方食品行業(yè)和安全監(jiān)管方面存在許多薄弱環(huán)節(jié)。為了解決嬰幼兒乳粉的安全問題，我國從2008年“三聚氰胺”事件以來，我國對嬰幼兒配方食品的標準進行整頓，并出臺了一系列迄今為止最嚴格的法規(guī)制度，對嬰幼兒配方乳粉的配方、生產(chǎn)、銷售的全過程進行嚴格監(jiān)管，以期重塑消費者對國產(chǎn)奶粉的信心。從近幾年的監(jiān)督抽檢結(jié)果可知，我國嬰幼兒配方乳粉的質(zhì)量得到了極大的提高。但為了促進我國嬰兒配方食品的良性發(fā)展，仍然需要對嬰幼兒配方食品中一些可能存在的污染物進行研究。

在特定條件下，羰基化合物（還原糖）和氨基化合物（蛋白質(zhì)、氨基酸）發(fā)生非褐變的美拉德反應，使得反應后的食物色香味俱全，但在此條件下容易人為產(chǎn)生有害物質(zhì)—丙烯酰胺（Acrylamide，AA）[1]。一般認為，丙烯酰胺主要存在于高溫（100℃以上）煎炸、烘烤的食品中，如油炸土豆片、薯條、面包、餅干和谷物早餐等[2]。

嬰幼兒配方乳粉中含有與美拉德反應相關(guān)的并易于形成丙烯酰胺的化學物質(zhì)，如含羰基的化合物（乳糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖等）和含氨基的化合物（氨基酸），并且在加工過程中也會經(jīng)歷噴霧干燥等加熱過程，所以也會有產(chǎn)生丙烯酰胺的可能性。最近，德國科學家有報道稱在一些嬰兒食品中發(fā)現(xiàn)較高的丙烯酰胺,有的含量甚至相當于炸薯條的2倍[3]。研究表明，對人和動物而言，丙烯酰胺主要是一種神經(jīng)毒素。其次，它還具有一定的致癌性、致突變性和生殖毒性[4-6]，國際癌癥研究所（IARC）將其列為2類致癌物（2A）即人類可能致癌物。

目前檢測食品中丙烯酰胺的國標檢測方法（GB 5009.204-2014）只針對熱加工食品，不適用于嬰幼兒乳粉中丙烯酰胺的檢測。根據(jù)嬰幼兒乳粉中有毒有害物質(zhì)的安全監(jiān)管要求，丙烯酰胺也已被列入監(jiān)管項目，因此，及時尋求簡便、快速、準確、敏感性高的嬰幼兒乳粉中的丙烯酰胺檢測方法才能滿足日趨嚴格的殘留限量要求，從而保障廣大嬰幼兒的身體健康。

根據(jù)文獻檢索資料獲知，國內(nèi)外測定丙烯酰胺的常用方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]、高效液相色譜法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[10-13]，其他還有生物傳感器快速檢測[14]、微分脈沖伏安法[15]、直接競爭酶聯(lián)免疫法[16]等一些非常規(guī)檢測方法。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要進行衍生，導致前處理時間較長，溶劑消耗大；高效液相色譜法的檢測靈敏性較低，檢測結(jié)果存在假陽性。針對上述存在的問題，本文中先將樣品經(jīng)水溶解，用乙腈去除蛋白，正己烷除脂，采用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀進行檢測，同位素內(nèi)標定量，該方法前處理簡單，靈敏度高，適用于嬰幼兒乳粉中丙烯酰胺的檢測。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

嬰幼兒配方乳粉，市購或檢驗樣品。

甲醇、乙腈、正己烷（色譜純），德國Fisher公司；丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺同位素內(nèi)標（w≥99%），美國Sigma公司。

串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（6410型）、液相色譜儀（1200型），美國Agilent公司；超聲波清洗儀（KQ-5200型），昆山市超聲儀器有限公司；去離子水發(fā)生器，美國milli-Q公司。

1.2 標準溶液

丙烯酰胺標準儲備液：準確稱取10.0 m g的標準品于10 m L容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1 m g/m L的標準儲備液，-18℃以下保存。

13C3-丙烯酰胺同位素內(nèi)標儲備液：準確稱取10.0 m g的同位素內(nèi)標于10 m L容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1 m g/m L的標準儲備液，-18℃以下保存。

用甲醇將丙烯酰胺標準儲備液和13C3-丙烯酰胺同位素內(nèi)標儲備液分別配制成濃度為0.5μg/m L的中間濃度標準溶液和中間濃度同位素內(nèi)標溶液，4℃以下保存。

基質(zhì)標準校準溶液：稱取陰性樣品，先加入20μL的中間濃度同位素內(nèi)標溶液，再加入適量的中間濃度標準溶液，使丙烯酰胺最終添加濃度分別為5 ng/m L、10 ng/m L、20 ng/m L、50 ng/m L、100 ng/m L。

1.3 樣品處理

準確稱取1.0 g樣品（精確至0.01 g），置于10 m L具塞比色管中，加入2 m L水，渦旋30 s充分溶解后，再依次加入中間濃度內(nèi)標溶液20μL，乙腈3 m L，具塞振搖1 min，超聲提取10 min，靜置，待蛋白質(zhì)沉淀后，吸取1 m L上清液用4 m L乙腈飽和的正己烷液液分配，除去脂肪，過0.20μm有機濾膜后，待用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 分析條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：H ypersil GOLD C18柱，1.9μm，50 mm×4.6 mm（i.d.）；流速0.20 m L/min；柱溫：25℃；進樣量5μL。

流動相：流動相：水（A）+甲醇（B）；梯度洗脫：0～5 min，B保持4%；5～5.1 min，B由4%線性遞增至100%；5.1～10 min，B保持100%；10～10.1 min，B由100%線性遞減至4%；10.1～15 min，A保持4%。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測；干燥氣：N2；霧化氣壓力：275.8 kPa；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：8 L/min。丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺內(nèi)標質(zhì)譜分析的條件參數(shù)如下表1所示。

表1 標準品的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取溶液選擇

丙烯酰胺既易溶于水，又溶于乙腈。同時，嬰幼兒乳粉基質(zhì)復雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，所以本方法在樣品中先加入2 m L水，渦旋1 min，使樣品中丙烯酰胺充分溶解，再加入3 m L乙腈，去除樣品中蛋白質(zhì)，再用乙腈飽和的正己烷除脂。這種前處理的方法簡便快速，定量限低于國標方法（10μg/kg），加標回收率高（平均加標回收率＞85%），可以完全滿足實際檢測要求。

2.2 基質(zhì)效應的影響

化學分析中，基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分。基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準確性。乳粉富含油脂蛋白質(zhì)，為了消除測定液中存在的基質(zhì)效應，本方法首先在前處理過程中采取除油除蛋白處理，同時采用空白樣品同位素內(nèi)標法定量，極大程度消除測定中的基質(zhì)效應，同時又明顯提高了定量的準確性。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣方式分別將濃度為200 ng/m L的丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺內(nèi)標用蠕動泵注入離子源中，在正離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到丙烯酰的分子離子峰為72.1。以該離子峰為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強度比例達到最大時為最佳，得到丙烯酰胺的最佳質(zhì)譜參數(shù)。由于丙烯酰胺分子量較小，汽化溫度較高時，分子結(jié)構(gòu)已斷裂，造成離子化效率不高，因此，本方法選擇干燥氣溫度為300℃。同時，在碰撞電壓為10 eV時，m/z 44.1和m/z 55.1碎片離子的強度比較大，因此選擇這兩個離子作為定量及定性檢測離子。相同條件下，得到13C3-丙烯酰胺內(nèi)標分子離子峰為75.0，定量離子為58.0。

圖1 碰撞能量為10 eV時丙烯酰胺的質(zhì)譜圖

2.4 色譜條件的優(yōu)化

2.4.1 色譜柱的選擇

為了有利于色譜峰的分離及鋒形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8μm）、H ypersil GO LD C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9μm）和Agilent Extend-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5μm）進行分離試驗，發(fā)現(xiàn)H ypersil GOLD C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9μm）峰形及出峰時間較為合適。

2.4.2 色譜分離條件選擇

丙烯酰胺為強極性化合物，色譜柱上保留較弱，為了有利于色譜峰的分離及檢測的要求，本方法采用水-甲醇為流動相，利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果效果，測試開始時，流動相中水-甲醇的比例為96∶4，然后在0～5 min保持此將比例，這一部分主要是使測定液中目標化合物和極性較強的雜質(zhì)相分離，5～5.1 min內(nèi)將改變二者的比例為0∶100，5.1～9 min保持此比例，這一部分主要是洗脫測定液中色譜柱上保留較強的雜質(zhì)。通過上述兩步梯度，在9 min內(nèi)，可以較好的分離測定液中的丙烯酰胺，從圖2中可以看出丙烯酰胺得到較好的分離。

圖2 丙烯酰胺加標樣品的MRM色譜圖

2.5 標準曲線和方法檢出限

按濃度由小到大的順序，將基質(zhì)標準溶液分別注入高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀中，按上述儀器條件進行測定，得到丙烯酰胺及其內(nèi)標峰面積。以基質(zhì)標準溶液的濃度為橫坐標，以目標化合物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線，并計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。得到的標準曲線線性范圍為10.0～200.0μg/L，回歸方程為y=1.0365x-0.0152（y為峰面積，Counts；x為濃度，ng/m L）；線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。同時用空白樣品進行加標實驗，根據(jù)信噪比均大于3的條件設(shè)定檢出限，得到方法的檢出限為5μg/kg，根據(jù)信噪比大于10的條件設(shè)定定量限，得到方法的定量限為10μg/kg。

2.6 回收率和精密度

分別準確稱取已知空白樣品6份，每份1.00 g，共3組，分別加入添加水平為10μg/kg、20μg/kg、100 μg/kg的丙烯酰胺標準品，再均添加50μg/kg內(nèi)標標準品，按樣品處理條件進行前處理后上機測定，結(jié)果見表2。從表2中可看出，不同濃度平均加標回收率為92.2%～104.8%，平均相對標準偏差為2.37%～9.61%（n=6），滿足試驗要求。

表2 丙烯酰胺的加標回收率

2.7 實際樣品分析

利用本方法對市場銷售的50種嬰幼兒營養(yǎng)乳粉進行檢測，其中9個樣品檢出檢出丙烯酰胺，檢出濃度范圍為5.60μg/kg～11.7μg/kg，檢出率為18%。上述結(jié)果表明，丙烯酰胺確實存在于嬰幼兒營養(yǎng)乳粉中，其對嬰幼兒健康存在的風險應當引起國家監(jiān)管部門及生產(chǎn)企業(yè)重視。

圖3 丙烯酰胺陽性樣品（丙烯酰胺濃度11.7μg/kg）的MRM色譜圖

3 結(jié) 論

本文建立了嬰幼兒乳粉中丙烯酰胺殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法樣品加標回收率方法回收率為92.2%～104.8%，相對標準偏差（RSD）為2.37%～9.61%（n=6）。該方法前處理簡單，適合于大量樣品的快速篩查，方法的靈敏度和準確度均滿足國家標準方法的檢測要求，適用于嬰幼兒乳粉中丙烯酰胺殘留的監(jiān)控檢測。根據(jù)市售嬰幼兒乳粉樣品的分析，丙烯酰胺殘留的檢出率達到18%，

檢驗樣品中最高殘留量大于10μg/kg，世界衛(wèi)生組織2000年公布的人均每日丙烯酰胺攝入量為每公斤體重0.3～0.8μg，嬰幼兒作為以乳粉為主要食物的人群，乳粉的攝入量較高，故具有較高的安全風險，建議對嬰幼兒乳粉中的丙烯酰胺殘留進行嚴格的風險監(jiān)控。