響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲奶酪加工工藝

王童，逄曉陽(yáng)，蘆晶，楊寶雨，馬長(zhǎng)路，張書(shū)文，呂加平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100093）

0 引 言

紅曲類(lèi)產(chǎn)品因其天然的色澤、特有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值廣受中國(guó)消費(fèi)者歡迎[1]。紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中含有許多生物活性物質(zhì)，如莫納卡琳K，γ-氨基丁酸（GABA）、紅曲色素和紅曲多糖等，對(duì)預(yù)防治療高血壓、降低膽固醇、改善血液循環(huán)系統(tǒng)等方面都有很好的效果[2-4]。目前，青白霉和白地霉作為干酪中的輔助發(fā)酵劑已得到廣泛應(yīng)用[5-6]。將紅曲霉用于霉菌干酪的加工，以改善霉菌干酪的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)特性，制作出一款適合中國(guó)消費(fèi)者口味的特色干酪不失為一種新的嘗試。

本研究以生牛乳為原料，以霉菌干酪工藝為基礎(chǔ)，將紅曲霉作為輔助發(fā)酵劑，選取紅曲奶酪關(guān)鍵操作點(diǎn)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，以凝乳得分為指標(biāo)進(jìn)行篩選，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化紅曲奶酪的加工工藝。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

牛乳，發(fā)酵劑，凝乳酶，紅曲霉菌種。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320 pH計(jì)，BSA124S-CW型電子天平，HDL超凈工作臺(tái)，LHS150/250 HC-II恒溫恒濕箱，UV-1800紫外分光光計(jì)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋，自制干酪槽，干酪刀，干酪板，模具等。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉干酪加工工藝

原料牛乳→標(biāo)準(zhǔn)化→殺菌（75℃，15 s）→冷卻（32℃）→接種乳酸菌發(fā)酵劑和紅曲霉菌種→發(fā)酵（32℃）→加凝乳酶→切割→攪拌→入模排乳清→鹽漬（2%）→加后熟菌種（1%）→后熟（12～14℃，RH 95%）

1.3.2 紅曲霉發(fā)酵液制備方法

將紅曲霉在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d后，用無(wú)菌水洗滌收集孢子得到濃度為1.0×105的孢子液，以5%的接種量接種到已滅菌5%馬鈴薯全粉溶液中，30℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)4 d，得到色值40 U/mL的紅曲霉發(fā)酵液，文中紅曲霉接種量為紅曲霉發(fā)酵液添加量。

1.3.3 凝乳效果評(píng)價(jià)

凝乳效果評(píng)價(jià)采用加權(quán)系數(shù)法，以凝乳感官、乳清OD值、凝乳時(shí)間、產(chǎn)品得率為指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)定。綜合評(píng)定總分為100分，其中凝乳感官、乳清OD值、凝乳時(shí)間、產(chǎn)品得率各為30，30，20和20分；具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

（1）干酪產(chǎn)品得率計(jì)算。干酪產(chǎn)品得率=終產(chǎn)品質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%。

（2）干酪凝乳時(shí)間的確定。從加入凝乳酶到凝乳適宜切割所需要的時(shí)間。

（3）干酪凝乳愈合時(shí)間的確定。從凝乳切割到開(kāi)始裝入模具所需要的時(shí)間。

（4）乳清OD值的測(cè)定。根據(jù)乳清濃度，適度稀釋后在480 nm處測(cè)定。

表1 干酪凝乳效果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 影響紅曲奶酪工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 發(fā)酵劑添加量對(duì)對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

采用60～65℃，30 min殺菌，發(fā)酵劑接種量分別為0.025，0.05，0.1，0.15，0.2 g/L；凝乳酶添加量為40 IMCU/L（IMCU為酶活力單位International Milk-Clotting Units縮寫(xiě)），凝乳溫度32℃的工藝制作干酪，測(cè)定并計(jì)算其凝乳得分。

1.4.2 凝乳酶添加量對(duì)對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

采用60～65℃，30 min殺菌，發(fā)酵劑接種量0.1 g/L，凝乳酶添加量分別為10，20，40，60，80 IMCU/L，凝乳溫度32℃的工藝制作干酪，測(cè)定并計(jì)算其凝乳得分。

1.4.3 紅曲霉接種量對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

采用60～65℃，30 min殺菌，發(fā)酵劑接種量0.1 g/L，紅曲霉接種量分別為1%，3%，5%，10%的發(fā)酵液，凝乳酶添加量為40 IMCU/L，凝乳溫度為32℃的工藝制作干酪，測(cè)定并計(jì)算其凝乳得分。

1.4.4 凝乳愈合時(shí)間對(duì)對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

采用60～65℃，30 min殺菌，發(fā)酵劑接種量0.1 g/L，凝乳酶添加量為40 IMCU/L，凝乳溫度為32℃，紅曲添加量分別為3%，凝乳愈合時(shí)間分別為0，5，10，15 min的工藝制作干酪，測(cè)定并計(jì)算其凝乳得分。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉干酪加工工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化紅曲奶酪加工工藝選擇發(fā)酵劑添加量A、凝乳酶添加量B、紅曲酶接種量C、凝乳愈合時(shí)間D為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素，每個(gè)自變量因素分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，以凝乳得分為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用過(guò)Design Expert 8.0.6.1軟件分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)設(shè)定為三次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為三次平行試樣測(cè)定結(jié)果的平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)方法，P≤0.05認(rèn)為結(jié)果顯著差異，整個(gè)數(shù)據(jù)處理是采用SPSS 24.0軟件。響應(yīng)面繪制及模型建立采用Design Expert 8.0.6.1軟件處理。

表2 中心組合Box-Behnken方案設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉干酪工藝的單因素試驗(yàn)及結(jié)果

圖1 發(fā)酵劑添加量對(duì)對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵劑添加量的增加，凝乳時(shí)間逐漸縮短，但當(dāng)發(fā)酵劑添加量為0.05 g/L時(shí)，形成的凝塊質(zhì)地過(guò)軟，且得率較低。當(dāng)添加量為0.2 g/L時(shí)，凝塊質(zhì)地太硬、粗糙呈顆粒狀。發(fā)酵劑發(fā)酵凝乳塊中的乳糖產(chǎn)生乳酸，乳酸引發(fā)酪蛋白發(fā)生特定的化學(xué)變化，使得有些磷酸鈣會(huì)溶解，乳糖等乳清成分重新進(jìn)入融入凝塊，代替已耗用的組分，凝塊內(nèi)部和周?chē)乃岫仍龃髸?huì)進(jìn)一步引起凝塊收縮[10-12]。發(fā)酵劑菌株活力越強(qiáng)，產(chǎn)酸速率就越快，凝塊收縮程度就越大，排出水分速度也越快。過(guò)大的發(fā)酵劑添加量，導(dǎo)致產(chǎn)生的乳酸量過(guò)多，會(huì)造成凝乳快速收縮而析出乳清，形成的凝塊粗糙、松散、有渣粒感[13]。凝乳硬度大小是凝乳中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的反映，凝乳的質(zhì)量好壞直接影響到干酪的質(zhì)構(gòu)和得率[14]。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，0.1 g/L的發(fā)酵劑添加量效果較好。

圖2 凝乳酶添加量對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

由圖2可知，隨著凝乳酶添加量的增加，凝乳時(shí)間逐漸縮短，乳清OD值逐漸減小，得率增加，但添加量為20 IMCU/L時(shí)，凝塊較軟，不易切割；添加量為80 IMCU/L時(shí)，凝塊質(zhì)地粗糙，乳清很容易析出。凝乳酶添加量的不同會(huì)造成干酪排乳清后酶的滯留量不同，而酶的滯留會(huì)影響干酪中的蛋白水解和干酪的功能特性[15]。凝乳酶的量太少，會(huì)造成凝乳強(qiáng)度差，在后期切割攪拌過(guò)程中,一部分蛋白和脂肪等成分隨乳清排出，導(dǎo)致干酪產(chǎn)率降低。凝乳酶量過(guò)多，造成過(guò)多的酶滯留在干酪中，在干酪后期成熟過(guò)程中，過(guò)度水解蛋白，產(chǎn)生一些苦味肽，影響干酪風(fēng)味和功能特性且凝乳的強(qiáng)度較小較軟的凝乳[16-17]。雷蕾等研究了凝乳酶的不同添加量對(duì)干酪品質(zhì)的影響添加量越高，蛋白質(zhì)含量越高，水分含量越低，干酪的硬度、融化性和油脂析出越高。但過(guò)多的凝乳酶會(huì)造成干酪有更大的蛋白水解，使干酪有苦味[18]。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凝乳酶綜合試驗(yàn)結(jié)果選擇40 IMCU/L的添加量為凝乳酶的最適添加量。

圖3 紅曲霉接種量對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

由圖3可知，隨著紅曲霉接種量的增加，凝乳時(shí)間先縮短后增加，得率也是先增大后減小，添加量為1%，凝乳時(shí)間稍長(zhǎng)，得率稍低；紅曲霉接種量為3%時(shí)，得率最大且凝乳時(shí)間最短；陸曉斌等人發(fā)現(xiàn)，紅曲霉發(fā)酵液具有一定的凝乳能力，因?yàn)榧t曲霉在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生一些凝乳酶，所以在一定范圍內(nèi)，當(dāng)紅曲霉發(fā)酵液添加量增大時(shí)，會(huì)對(duì)凝乳有一定的促進(jìn)作用，在干酪生產(chǎn)中可以節(jié)約凝乳酶的使用量，降低成本[19-21]。紅曲霉接種量為10%時(shí)，凝塊質(zhì)地疏松，蛋白質(zhì)和脂肪流失嚴(yán)重，這主要是因?yàn)榧t曲霉發(fā)酵液中的淀粉類(lèi)物質(zhì)混入牛奶中，影響干酪凝乳的質(zhì)地，破壞凝乳的結(jié)構(gòu)；由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，紅曲霉接種量為3%時(shí)，凝乳時(shí)間較短，凝塊質(zhì)地柔軟且富有彈性，且得率較高，比較適合干酪的加工。綜合考慮，選擇紅曲霉接種量為3%為最優(yōu)接種量。

圖4 凝乳愈合時(shí)間對(duì)紅曲奶酪凝乳得分的影響

由圖4可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凝乳得分先增大后減小，因?yàn)楦衫胰樗峋l(fā)酵產(chǎn)生的乳酸會(huì)顯著降低凝乳的pH值，促使凝乳酶的活性增加，加速酪蛋白膠團(tuán)的產(chǎn)生，促進(jìn)凝乳的形成[22-23]。但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)使膠束中磷酸鈣的溶解作用增加，降低了酪蛋白膠團(tuán)表面的靜電荷，使膠團(tuán)之間的靜電斥力下降，從而導(dǎo)致凝乳中乳清大量析出，凝乳塊顯著收縮，凝乳變硬，彈性變差，產(chǎn)品得率下降；排乳清時(shí)間過(guò)短時(shí)，則凝乳中水分含量較高，凝乳酶殘留量增加，同樣會(huì)對(duì)干酪品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[24-25]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析，選擇凝乳愈合時(shí)間10 min為最優(yōu)凝乳愈合時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化糖化工藝試驗(yàn)結(jié)果及分析

響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲奶酪加工工藝的Box-Behnken設(shè)計(jì)及27組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。通過(guò)Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)紅曲霉干酪加工的最優(yōu)工藝參數(shù)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表8。對(duì)表7中的凝乳得分進(jìn)行多元回歸分析，得到發(fā)酵劑添加量（A）、凝乳酶添加量（B）、紅曲霉接種量（C）、凝乳愈合時(shí)間（D）的二次回歸模型，該式表達(dá)了凝乳效果（Y）與各因素之間的變化規(guī)律，其二次多元回歸模型為：

Y=-52.29583+1105.91667A+1.94625B+11.40417C+5.93833D-5.30000AB-33.25000AC+3.00000AD-0.041250BC+7.00000E-003BD-0.18500CD-4143.33333A2-0.017677B2-0.63333C2-0.28983D2。

得到最佳工藝組合為：發(fā)酵劑添加量0.1 g/L，紅曲霉接種量3.1%，凝乳酶添加量40 IMCU/L，凝乳愈合時(shí)間為9.9 min，理論凝乳得分89.53，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次平均值89.10，與預(yù)測(cè)值基本吻合。

對(duì)建立的模型采用二次型進(jìn)行分析，利用t檢驗(yàn)和P值可判斷各相關(guān)系的顯著性，干酪凝乳效果評(píng)分變化所建立的回歸模型變量間關(guān)系（P＜0.01）極顯著，模擬變量失擬（P＞0.05）不顯著，表明模型選擇正確，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9825，矯正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.9620表明響應(yīng)值的變化能較好的描述各因素與響應(yīng)值之

表3 發(fā)酵劑添加量對(duì)紅曲奶酪凝乳效果的影響

表4 回歸方程的方差分析結(jié)果

間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型擬合程度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可有效分析和預(yù)測(cè)紅曲干酪的凝乳效果。在各因素所選擇的水平范圍內(nèi)，二次項(xiàng)A2，B2，C2，D2對(duì)凝乳效果評(píng)分影響顯著。發(fā)酵劑添加量(A)、凝乳酶添加量（B）、紅曲霉接種量（C）、凝乳愈合時(shí)間（D）的交互作用項(xiàng)BC交互作用顯著（P＞0.05），AB，AC，CD交互作用極顯著（P＜0.01）。

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖可以直觀的看到各因素間的交互作用情況，圓形表示兩因素間交互作用不明顯，橢圓形則表示較明顯，具體結(jié)果如圖5所示。

圖5 三維響應(yīng)曲面圖

由圖5(a)可以看出，發(fā)酵劑添加量(A)和凝乳酶添加量(B)存在極顯著的相互作用，隨著發(fā)酵劑和凝乳酶添加量的增加，凝乳效果得分均呈現(xiàn)先升高后降低的變化。添加發(fā)酵劑主要作用是產(chǎn)酸，是牛奶的p H降低，提高凝乳酶活力，促進(jìn)凝乳酶作用形成凝塊，是凝塊收縮容易排除乳清[26]。結(jié)合響應(yīng)面可以看出，發(fā)酵劑、凝乳酶添加量小，凝乳溫度低得到較差凝乳效果，這與前期單因素分析一致，但過(guò)高的凝乳酶、氯化鈣添加量和凝乳溫度也會(huì)降低凝乳效果。由圖5(b)可以看出，發(fā)酵劑添加量(A)和紅曲霉接種量(C)存在極顯著的相互作用，因?yàn)榧t曲霉發(fā)酵液中含有少量的凝乳酶，且紅曲霉發(fā)酵液呈酸性，加入后可以提高牛奶的酸度，故AC的交互作用和AB的交互作用類(lèi)似，即隨著發(fā)酵劑和紅曲霉發(fā)酵液添加量的增加，凝乳效果得分均呈現(xiàn)先升高后降低的變化。發(fā)酵劑添加量(A)凝乳酶添加量（B）和凝乳愈合時(shí)間(D)的交互作用不明顯。由圖5(c)可以看出，凝乳酶添加量（B）和紅曲霉接種量（C）的交互作用顯著，隨著凝乳酶和紅曲霉接種量的增加，凝乳效果得分均呈現(xiàn)先升高后降低的變化。因?yàn)榧t曲霉發(fā)酵液中含有少量凝乳酶，酸性的發(fā)酵液加入牛奶后還可以提高牛奶的酸度，在凝乳階段提高凝乳活力。由圖5(d)可以看出，紅曲霉發(fā)酵液添加量(C)和凝乳愈合時(shí)間(D)存在極顯著的相互作用，排乳時(shí)間很大程度上決定凝乳塊終水分的含量，因此對(duì)于凝乳塊的質(zhì)地有顯著影響，凝乳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均不利于良好凝乳的形成[27]。凝乳時(shí)間較短時(shí)，凝乳塊水分含量大，質(zhì)地柔軟，彈性較差；凝乳時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，凝乳塊的質(zhì)地顯著變硬，收縮嚴(yán)重，彈性差，易碎，排乳時(shí)間在30 min左右時(shí)，凝乳塊質(zhì)地細(xì)膩，彈性較好[28]。紅曲霉發(fā)酵液中含有少量凝乳酶，少量加入有利于凝乳形成，而添加量較大時(shí)，發(fā)酵液中的淀粉等物質(zhì)由于無(wú)法溶解與牛奶中，在凝乳階段會(huì)影響凝乳快的質(zhì)地，使其硬度和彈性變差。

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)面法對(duì)紅曲奶酪加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了發(fā)酵劑添加量、凝乳酶添加量、紅曲霉接種量、凝乳愈合時(shí)間對(duì)凝乳效果的二次回歸方程模型，經(jīng)檢驗(yàn)，模型準(zhǔn)確有效，可以用該模型分析預(yù)測(cè)上述因素對(duì)凝乳效果的影響。結(jié)合前期單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和響應(yīng)面優(yōu)化模型確定紅曲奶酪加工工藝為：發(fā)酵劑添加量0.1 g/L，紅曲霉接種量3.1%，凝乳酶添加量40 IMCU/L，凝乳愈合時(shí)間為9.9 min，理論凝乳得分89.53，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次平均值89.10，與預(yù)測(cè)值基本吻合。該研究表明，Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法可有效地優(yōu)化紅曲奶酪加工工藝。