超高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中5種核苷酸

馬世波，王錫青，夏克光，邱寧寧,石江傳

（圣元營養(yǎng)食品有限公司，山東青島 266400）

0 引 言

核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿基、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物。核苷酸主要參與構(gòu)成核酸，許多單核苷酸也具有多種重要的生物學(xué)功能，如與能量代謝有關(guān)的三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等。許多研究者認(rèn)為核苷酸是維持機體正常免疫功能的必須營養(yǎng)成分，可以增強嬰兒的機體免疫力和抗感染能力。美國兒科專家進(jìn)行的臨床對比研究結(jié)果顯示，用添加了與母乳等量核苷酸（72 mg/L）的奶粉喂養(yǎng)的嬰兒，比未添加核苷酸的代乳品喂養(yǎng)的嬰兒具有更強的免疫能力。另外核苷酸對腸道營養(yǎng)有著重要的作用，能夠促進(jìn)腸道細(xì)胞的生長、發(fā)育和修復(fù)，減少嬰兒腹瀉的發(fā)生率。還有研究表明飲食中添加核苷酸能促進(jìn)新生兒，尤其是早產(chǎn)兒脂蛋白的合成或分泌。核苷酸是母乳中天然存在的物質(zhì)，早在1965年，日本就在嬰兒奶粉中添加核苷酸，西班牙自1983年，美國自1989年也開始推薦使用。2005年中國衛(wèi)生部15號公告建議，核苷酸在嬰幼兒配方粉中的添加量為0.2～0.58 g/kg（以核苷酸總量計）。

目前，國內(nèi)外測定核苷酸的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[1]、離子交換色譜法、反相液相色譜法[2，3，11]和毛細(xì)管電泳法等。其中液相色譜-質(zhì)譜法在儀器維護(hù)等方面要求較高，同時核苷酸同位素內(nèi)標(biāo)難以取得，基質(zhì)效應(yīng)對離子化效率的影響導(dǎo)致檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度較難保證；核苷酸類屬于帶負(fù)電荷的物質(zhì)，應(yīng)用陰離子交換色譜可以進(jìn)行分離和定量，但離子色譜柱平衡時間長，檢測效率低；毛細(xì)管電泳法由于緩沖溶液的p H值對核苷酸的分離影響較大，容易造成檢測結(jié)果不穩(wěn)定。2016年頒布了GB 5413.40-2016《嬰幼兒食品和乳品中核苷酸測定》檢測標(biāo)準(zhǔn)，該方法采用高效液相色譜法對核苷酸進(jìn)行檢測[5]。在實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)一般C18色譜柱很難對5種核苷酸進(jìn)行很好的保留和分離，目標(biāo)化合物很容易受雜峰干擾，流動相中含有離子對試劑，色譜柱平衡時間較長，很容易發(fā)生保留時間漂移的情況，樣品前處理對雜質(zhì)的去除效果不理想，對色譜柱壽命影響較大。針對這種情況本文對樣品前處理以及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，使樣品前處理能夠去除更多的雜質(zhì)，選擇使用分離效果更好的色譜條件，使5種核苷酸都達(dá)到與雜質(zhì)的有效分離，從而保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀，配紫外檢測器（TUV）（美國Waters公司ACQUITY UPLC H-Class?System）；超純水儀（美國Millipore公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FE20K p H計（瑞士梅特勒-托利多公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：AMP(純度100%，批號：SLBD5646V)、CMP（純度99%，批號：SLBH 5184V）、GMP（純度99.8%，批號：097k0676）、UMP（純度99.1%，批號：BCBK2612V）、IMP（純度98%，批號：SLBB9123V），購自美國Sigma公司。

試劑與耗材：乙腈（色譜純）購自美國Thermofisher Scientific；磷酸二氫鈉（優(yōu)級純）、乙酸、磷酸（分析純）,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Oasis HLB固相萃取柱（6 cc/150 mg）,購自美國Waters公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)備

分別精密稱取UMP、AMP、CMP、IMP、GMP各10 mg，用純水溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，臨用前稀釋為4、8、12、16、20μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取嬰幼兒配方奶粉5 g，于100 mL三角瓶中，加20 mL 50℃熱水，超聲10分鐘使樣品充分溶解，冷卻至室溫后，用乙酸調(diào)節(jié)p H值到4.5，將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用超純水定容，濾紙過濾。取5 mL濾液，過Oasis HLB固相萃取柱，棄去最初約2 mL濾液后，收集流出液，用0.2μm微孔濾膜過濾，待分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm，2.1×100 mm；柱溫：50℃；檢測波長：254 nm；流動相：A為乙腈，B為10 mmol/L磷酸二氫鈉溶液，C為0.1%（v/v）磷酸水溶液；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：5μL；梯度洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

由于核苷酸極性很大，用普通反相色譜柱很難達(dá)到很好的保留和分離，對于這種極性較大的化合物一般會嘗試離子對色譜方法進(jìn)行分析[6]，但是實驗發(fā)現(xiàn)用離子對色譜方法對核苷酸進(jìn)行分析，存在以下問題：平衡時間很長，容易發(fā)生保留時間漂移，CMP與雜質(zhì)峰分離不佳，影響定量，色譜柱使用后難以清洗，再分析其他化合物容易出現(xiàn)異常。因此選擇合適的色譜柱是本實驗的關(guān)鍵因素。本實驗對比了Agilent

表1 核苷酸測定的梯度洗脫程序

ZORBAX-SB C18（250×4.6 mm，5μm）；waters symmetry C18（2.1×150 mm,3.5μm）；Phenomenex，Kinetex C18（2.1×100 mm,1.7μm）；welch materials ultimate AQ-C18（150×4.6 mm，5μm），waters Cortecs HILIC（2.1×100 mm，1.6μm）；waters BEH Amide（2.1×100 mm,1.7μm）這幾種色譜柱的分離效果。測定結(jié)果顯示waters BEH Amide（2.1×100 mm,1.7μm）色譜柱的分離效果最好，對核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，5種化合物的分離度均在3.0以上，對于奶粉樣品，5種核苷酸跟雜質(zhì)之間的分離度均在1.6以上，既能準(zhǔn)確的定性，又能精確的定量。其他幾種色譜柱都存在雜質(zhì)峰的干擾，特別是CMP保留時間過短，跟雜質(zhì)峰不能分離，影響定量準(zhǔn)確性?；蛘弑仨毷褂酶弑壤乃噙M(jìn)行洗脫，分析時間過長，且對色譜柱容易造成不可恢復(fù)的損傷，縮短色譜柱的使用壽命[7]。本實驗使用的BEH Amide色譜柱采用亞乙基橋雜化顆粒，1.7μm的粒徑使其具有更高的塔板數(shù)，分離效率更高，可以將5種核苷酸與雜質(zhì)有效分離。C18色譜柱和BEH Amide色譜柱分析5種核苷酸色譜圖分別如圖1、圖2所示。

2.2 前處理條件的確定

圖1 C18（250×4.6 mm，5μm）色譜柱分析實際樣品中5種核苷酸色譜圖

圖2 BEH Amide（2.1×100 mm,1.7μm）色譜柱分析標(biāo)樣及實際樣品中5種核苷酸色譜圖

嬰幼兒配方奶粉成分較為復(fù)雜，前處理方法是否合適對樣品分析非常重要。隨著嬰幼兒配方奶粉的發(fā)展，近年來嬰幼兒配方奶粉的營養(yǎng)成分也不斷增多，礦物質(zhì)、維生素以及其他多種功能性營養(yǎng)成分的復(fù)雜性給前處理帶來難度。如何在前處理中有效去除奶粉中的蛋白質(zhì)及脂肪等大分子兩性電解質(zhì)，并且不使核苷酸損失，提高回收率，成為改善前處理方法以及提高檢測方法的重要目標(biāo)。本研究處理奶粉樣品采用等電點結(jié)合固相萃取法作為樣品的前處理方法[12]。首先調(diào)節(jié)p H值為4.6，使大量蛋白質(zhì)在等電點沉淀，并通過濾紙過濾，從而達(dá)到分離的目的[9]。然后將濾液通過Oasis HLB固相萃取柱，核苷酸作為強極性化合物在該固相萃取柱上不保留，因此可以采用操作比較簡單的通過性凈化，雜質(zhì)在固相萃取柱上被吸附，而核苷酸不被吸附，從而達(dá)到進(jìn)一步凈化的目的[8]。從實驗來看，部分嬰幼兒配方奶粉不經(jīng)過固相萃取凈化會在UM P附近有雜質(zhì)峰干擾，經(jīng)過固相萃取后的樣液色譜圖中雜質(zhì)峰減小，色譜柱更耐用。同時本實驗考察了用不同方式沉淀蛋白的回收率，結(jié)果顯示用乙酸調(diào)節(jié)PH值回收率最高，用高氯酸調(diào)節(jié)PH值[9]以及用亞鐵氰化鉀、乙酸鋅等沉淀劑沉淀蛋白時核苷酸均有不同程度的損失[10]。有部分嬰兒配方奶粉在檢測時發(fā)現(xiàn)UM P峰附近有雜質(zhì)峰干擾，使用固相萃取后可以有效去除雜質(zhì)，使用固相萃取跟不用固相萃取對比色譜圖如圖3所示。

取同一嬰幼兒配方奶粉分別按低、中、高三個水平添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用乙酸、高氯酸、沉淀劑沉淀蛋白，測定回收率，結(jié)果對比如表2所示。

圖3 使用固相萃取前后對比

表2 不同的沉淀方式對核苷酸回收率的影響

對已知濃度的奶粉樣品進(jìn)行三個水平的添加回收率實驗，從以上數(shù)據(jù)可以看出，用乙酸沉淀蛋白，回收率在97%～102%，高氯酸沉淀蛋白回收率在87%～98%，沉淀劑沉淀蛋白回收率在88%～97%，實驗最終確定采用乙酸調(diào)節(jié)pH值沉淀蛋白。

2.3 方法精密度

對同一樣品進(jìn)行6次獨立測定，5種核苷酸的精密度均小于5%，測定結(jié)果見表3。

2.4 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限

測定逐級稀釋后的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以各組分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以對應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，m g/L）為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸分析，結(jié)果見表3，5種核苷酸線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.9995。取空白樣品加入適當(dāng)稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以信噪比為3時的含量計算檢出限，測得5種核苷酸的檢出限為1.5～2.0 m g/kg（見表4）。

2.5 樣品的檢測

運用本方法對市場上購買的5種品牌的嬰幼兒配方奶粉檢測了檢測，測定結(jié)果見表5，測定結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)注值相符，方法靈敏度、重復(fù)性、準(zhǔn)確性都比較滿意。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種超高效液相色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉中5種核苷酸的方法。該方法很好的解決了核苷酸這類強極性化合物用普通反相色譜不易分離的問題，前處理簡單有效，色譜峰形良好，很好的避免了雜質(zhì)峰干擾，各組分分離度都達(dá)到定量要求，能充分滿足嬰幼兒配方奶粉中核苷酸的日常檢測需求。

表3 精密度測定

表4 精密度測定

表5 5個嬰幼兒配方奶粉種5種核苷酸的含量