• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    光遺傳技術(shù)通過Wnt/β-Catenin通路對新生神經(jīng)元的影響*

    2019-07-03 08:52:04夏天光王景景魏孟廣呂方方孫洪濤
    關(guān)鍵詞:去極化動作電位遺傳學(xué)

    夏天光, 朱 旭,2, 王景景, 魏孟廣, 呂方方, 陳 翀, 梁 軍, 姜 偉, 孫 倩, 孫洪濤△

    (1. 武警特色醫(yī)學(xué)中心腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所, 天津 300162; 2. 邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外科, 河北 056002; 3. 天津大學(xué)醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院, 天津 300072)

    創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是導(dǎo)致青少年殘疾和死亡的主要原因之一[1,2]。TBI可導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)和記憶障礙,這是由于TBI引起的海馬神經(jīng)元死亡所致[3]。促進(jìn)神經(jīng)元再生被認(rèn)為是較好的治療TBI的策略之一,新生神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶中起著重要的作用[4]。然而,創(chuàng)傷后不能成熟的新生神經(jīng)元將在新生后第一周至第二周死亡。損傷區(qū)缺氧和毒素累積導(dǎo)致新生細(xì)胞成熟度下降[5,6]。因此,改善TBI后新生神經(jīng)元的存活率和誘導(dǎo)神經(jīng)元成熟是TBI后面臨的主要挑戰(zhàn)之一。

    在神經(jīng)元發(fā)育過程中,動作電位對新生神經(jīng)元的成熟和功能性突觸的形成至關(guān)重要[7]。研究人員利用電極刺激使細(xì)胞膜去極化產(chǎn)生動作電位激活神經(jīng)元回路[8]。光遺傳學(xué)方法中藍(lán)光可激活視紫紅質(zhì)通道蛋白-2(channelrhodopsin-2,ChR2),使膜去極化并觸發(fā)動作電位。特定啟動子下的ChR2工程細(xì)胞為膜去極化和神經(jīng)元興奮的研究提供一種新的且強(qiáng)有力的方法。利用光遺傳學(xué)方法產(chǎn)生動作電位克服了傳統(tǒng)技術(shù)的局限性,可以從時間和空間上精確操控新生神經(jīng)元的電生理活動。

    Wnt信號通路主要調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等過程,其中,經(jīng)典的Wnt/β-actenin 信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要的作用[9]。本研究中,我們用攜帶DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSCs),DCX識別新生神經(jīng)元并觀察光遺傳學(xué)能否通過ChR2通道蛋白誘導(dǎo)膜電位產(chǎn)生動作電位促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟。同時,我們進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟過程中Wnt/β-catenin信號途徑相關(guān)分子水平的變化,以探索Wnt/β-catenin和新生神經(jīng)元成熟的關(guān)系,為后續(xù)研究光遺傳學(xué)誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟治療TBI奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑與儀器

    實(shí)驗(yàn)動物為孕14 d的SD大鼠,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)儀器:離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司),SA300V型全自動高壓滅菌儀(美國Thermo Fisher公司),自動超純水儀(美國Thermo Fisher公司),二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司),相差倒置熒光顯微鏡及照相裝置(德國Leica公司)。實(shí)驗(yàn)試劑:熒光標(biāo)記二抗(Sigma公司),神經(jīng)巢蛋白(Nestin)抗體(Pharmingen公司),胎牛血清和含有F12的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。DCX-ChR2-EGFP和DCX-EGFP基因的慢病毒(中國上海和元生物公司)。

    1.2 NSCs的分離與培養(yǎng)

    NSCs分離與培養(yǎng)步驟[10]如下:將SD大鼠乙醚麻醉后置于75%乙醇中浸泡1 min,冰上取胎鼠大腦皮層組織,眼科剪剪碎,置于培養(yǎng)基中用200目不銹鋼濾網(wǎng)進(jìn)行研磨,過濾后得到細(xì)胞懸液。將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 r/min離心5 min,棄上清液。經(jīng)0.25%胰酶消化后再次離心5 min,棄上清后加入NSCs培養(yǎng)基(DMEM/F12,20 ng/ml EGF,20 ng/ml bFGF和2% B27添加劑)重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù),以1.5×106cells/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中。2~3 d靜置換液,每7 d傳代1次。

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

    實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組(n=3):對照組、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2組。其中對照組為正常培養(yǎng)的NSCs(NSCs組);NSCs+EGFP組為攜帶DCX-EGFP基因慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞組;NSCs+ChR2組為攜帶DCX-ChR2-EGFP基因慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞組。

    1.4 慢病毒感染攜帶DCX-ChR2-EGFP和DCX-EGFP基因的新生神經(jīng)元并采用光學(xué)刺激新生神經(jīng)元

    分別用攜帶DCX-ChR2-EGFP和DCX-EGFP基因的慢病毒感染新生神經(jīng)元。病毒顆粒滴度約為每毫升3×108粒。感染復(fù)數(shù)(MOI)為1∶50。然后采用470 nm DPSS激光器(OEM 激光系統(tǒng))激發(fā)產(chǎn)生藍(lán)色激光,通過標(biāo)準(zhǔn)的40倍浸水顯微鏡物鏡照射在培養(yǎng)基中(脈沖5 ms,2Hz)。病毒感染48 h后,連續(xù)3 d藍(lán)激光照射各組NSCs。

    1.5 采用L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米或β-catenin抑制劑Dkk1干預(yù)NSCs+ChR2組細(xì)胞

    慢病毒DCX-ChR2-EGFP感染NSCs 48 h后,采用L-型鈣通道阻斷劑100 μmol/L維拉帕米或50 μg/ml的β-catenin抑制劑Dkk1處理NSCs+ChR2組細(xì)胞,然后行Western blot檢測各組MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表達(dá)水平。

    1.6 Western blot檢測各組MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2、TCF4和β-catenin蛋白表達(dá)水平

    提取對照組、NSCs+EGFP組和NSCs+ChR2組細(xì)胞蛋白,根據(jù)BCA試劑盒測定上清液中蛋白質(zhì)的濃度,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離,NC膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗(MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2、TCF4和β-catenin),4℃孵育過夜,次日,小鼠或抗兔IgG二抗(1∶5 000)在37℃下孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光顯色法顯色并曝光顯影。用定量軟件(Bio-Rad)測定灰度值。

    在NSCs+ChR2組培養(yǎng)基中加入100 μm維拉帕米或50 μg/ml Dkk 1進(jìn)行功能阻斷實(shí)驗(yàn)。再按照上述步驟測定MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白的表達(dá)。

    1.7 免疫熒光染色檢測各組DCX和NeuN的表達(dá)情況

    光刺激3 d后,各組細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定30 min,加入0.5% Triton X-100破膜30 min, BSA封閉15 min,加入一抗DCX和NeuN 4℃孵育過夜,次日,加入相應(yīng)的熒光二抗孵育1 h,然后行Hoechst染色后緩沖甘油封片,在倒置熒光顯微鏡下觀察。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 3組NeuN+陽性細(xì)胞和NeuN+/Hoechst比值的比較

    各組細(xì)胞經(jīng)470 nm 藍(lán)光連續(xù)照射3 d后,NSCs組、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2三組均有成熟神經(jīng)元表達(dá)的NeuN+(紅色),NeuN+細(xì)胞密度分別為7350±632、8400±713、18700±1185。NSCs+ChR2組NeuN+陽性細(xì)胞密度顯著高于NSCs組和NSCs+EGFP組(圖1A,P<0.01),而NSCs組和NSCs+EGFP組二者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組NeuN+/Hoechst比值分別為82±7、80±4和93±8。NSCs+ChR2組NeuN+/Hoechst比值顯著高于NSCs組和NSCs+EGFP組(P<0.05,圖1見彩圖頁Ⅰ)。

    2.2 ChR2通道對MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)水平的影響

    與NSCs組和NSCs+EGFP組相比,MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá)(P<0.01)。NSCs組與NSCs+EGFP組兩者比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2,表1)。

    Fig.2The effects of ChR2 channel on the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1and GluR2 protein

    2.3 維拉帕米拮抗鈣離子通道對MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)水平的影響

    與NSCs組對比, MAP2、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。加入維拉帕米抑制劑(Verap組)后,與NSCs+ChR2組相比,MAP2、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)明顯被抑制(P<0.05)。NeuN蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá),與NSCs組對比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入維拉帕米抑制劑(Verap組)后,NeuN蛋白表達(dá)明顯被抑制,與NSCs+ChR2組對比(圖3,表2)。

    Tab. 1 Quantitative analysis of the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 n=3)

    NSCs: Neural stem cells

    **P<0.01vsNSCs group

    Fig.3The effects of calcium channel blocker verapamil on the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 protein

    2.4 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin和TCF4的表達(dá)結(jié)果

    β-catenin和TCF4蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá),與NSCs組和NSCs+ EGFP組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖4,表1)。

    2.5 β-catenin抑制劑Dkk1對MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)的影響

    MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白在NSCs+ChR2組呈高表達(dá),與NSCs組對比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。加入β-catenin抑制劑Dkk1(Dkk1組)后,與NSCs+ChR2組對比,MAP2、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白表達(dá)明顯被抑制(P<0.05,P<0.01)。NeuN蛋白表達(dá)明顯被抑制,與NSCs+ChR2組對比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05,圖5,表3)。

    3 討論

    TBI后新生神經(jīng)元的成熟度較低,本研究選擇光遺傳學(xué)方法激活新生神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位,以提高神經(jīng)元的成熟度。為了得到具有DCX-ChR2-EGFP陽離子通道的新生神經(jīng)元,本研究利用攜帶DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染從胎鼠提取并在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。470 nm的藍(lán)光可以有效刺激ChR2通道開放,陽離子內(nèi)流產(chǎn)生細(xì)胞膜動作電位。這些電生理的變化可以通過Wnt/-catenin信號通路促進(jìn)新生神經(jīng)元的成熟。

    電活動存在于成體神經(jīng)發(fā)生的各個階段,通過基因表達(dá)和信號調(diào)節(jié)影響新生細(xì)胞的成熟,尤其在神經(jīng)分化階段起著關(guān)鍵作用[11,12]。研究表明,有絲分裂后神經(jīng)細(xì)胞通過膜去極化引起鈣離子通道開放,鈣離子內(nèi)流來影響神經(jīng)元的存活、成熟并產(chǎn)生功能活動[13]。細(xì)胞膜上的鈣通道開放可以抑制新生神經(jīng)元分化為膠質(zhì)細(xì)胞并激活NeuroD基因使新生神經(jīng)元向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化[7]。細(xì)胞去極化的方法很多,然而傳統(tǒng)的電生理技術(shù)缺乏精確控制對靶向細(xì)胞的刺激,無法達(dá)到調(diào)控神經(jīng)元或特定種類細(xì)胞電生理活動的目的[14]。光遺傳學(xué)是利用基因工程將光敏感性離子通道蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞或動物體內(nèi),以特定波長的外源性光照射(刺激)激活或抑制表達(dá)在細(xì)胞或動物體內(nèi)的光敏感通道蛋白形成離子流,引起細(xì)胞膜電位超級化或去極化,從而達(dá)到調(diào)控從時間和空間上精確調(diào)控細(xì)胞的電生理活動的目的[15]。如今,光遺傳學(xué)通過激活靶向基因刺激神經(jīng)元電生理活動的技術(shù)已被用于多種實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭醒芯繌?fù)雜神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的功能[16,17]。然而,大多數(shù)研究使用光遺傳學(xué)調(diào)控細(xì)胞群或神經(jīng)回路。光遺傳學(xué)調(diào)控光敏陽離子通道ChR2產(chǎn)生動作電位促進(jìn)神經(jīng)元成熟很少被研究。本研究中,光遺傳學(xué)作為細(xì)胞膜去極化產(chǎn)生動作電位的工具,CHR2通道是細(xì)胞產(chǎn)生電活動變化的途徑,利用DCX-ChR2-EGFP慢病毒感染細(xì)胞并表達(dá),驗(yàn)證光遺傳學(xué)促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCs組、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2三組均有成熟神經(jīng)元表達(dá),NSCs+ChR2組成熟神經(jīng)元陽性細(xì)胞密度顯著高于NSCs組和NSCs+EGFP組。提示光遺傳學(xué)能通過ChR2通道蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位并促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟。同時,還進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟過程中Wnt/β-catenin信號途徑相關(guān)分子水平的變化,以探索Wnt/β-catenin和新生神經(jīng)元成熟的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米或β-catenin抑制劑Dkk1后,神經(jīng)元的成熟過程受到抑制,說明光誘導(dǎo)ChR2通道產(chǎn)生動作電位與鈣離子內(nèi)流具有較高的相關(guān)性。

    Tab. 2 Quantitative analysis of the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 n=3)

    *P<0.05,**P<0.01vsthe NSCs group;#P<0.05,##P<0.01vsChR2 group

    Fig.4The expressions of β-catenin and TCF4 associated with Wnt/β-catenin signal channel

    Fig.5The effects of β-catenin inhibitor Dkk1 on the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 protein

    Tab. 3 Quantitative analysis of the expressions of MAP2, NeuN, Neurog2, NeuroD1 and GluR2 protein n=3)

    *P<0.05,**P<0.01vsthe NSCs group;#P<0.05,##P<0.01vsChR2 group

    DCX(Doublecortin)基因編碼一種40 kDa的雙鏈微管相關(guān)蛋白,缺乏DCX的新生神經(jīng)元會產(chǎn)生嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)缺陷和遲發(fā)性遷移。DCX主要在神經(jīng)元前體和新生神經(jīng)元中表達(dá)[18,19]。研究證實(shí),新生細(xì)胞成熟經(jīng)歷了兩個關(guān)鍵時期,一個是中間祖細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞時期,另一個是未成熟神經(jīng)元整合時期[20]。新生神經(jīng)元在這兩個關(guān)鍵時期均表達(dá)DCX。Walker等[21]從孕鼠,新生鼠和成年鼠腦中分離DCX陽性細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)DCX陽性細(xì)胞在神經(jīng)元前體階段的表達(dá)是較高的。另外,在成年人的神經(jīng)發(fā)生過程中,DCX只在增殖的神經(jīng)元祖細(xì)胞和有絲分裂后的神經(jīng)元前體中短暫表達(dá)[22]。慢病毒轉(zhuǎn)入DCX基因使新生神經(jīng)元具有較長的觀察時間窗。在本實(shí)驗(yàn)中,用攜帶DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染新生神經(jīng)元,利用DCX的表達(dá)水平檢測光遺傳學(xué)對細(xì)胞成熟度的影響,發(fā)現(xiàn)激光照射3 d后新生神經(jīng)元的DCX表達(dá)量明顯下降,證明光遺傳學(xué)方法促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟是可行的。

    Wnt信號通路在新生神經(jīng)元的神經(jīng)分化中起著重要的作用,近年來成為各種疾病機(jī)制研究的熱點(diǎn)[23]。Wnt信號通路中,β-catenin是TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活因子,同時調(diào)節(jié)Wnt靶基因的表達(dá),其中包括NeuroD1[24]。NeuroD1被證明在神經(jīng)元分化過程中具有至關(guān)重要的作用[25]。本研究用Western blot檢測β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平,并用β-catenin抑制劑Dkk1抑制Wnt/β-catenin信號通路后檢測神經(jīng)元成熟的相關(guān)蛋白MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2,發(fā)現(xiàn)新生神經(jīng)元的成熟與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)。

    本研究結(jié)果表明,光遺傳學(xué)通過激活ChR2通道蛋白誘導(dǎo)膜電位產(chǎn)生動作電位促進(jìn)新生神經(jīng)元成熟。體外誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟過程中Wnt/β-catenin信號發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究光遺傳學(xué)誘導(dǎo)新生神經(jīng)元成熟治療TBI奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    去極化動作電位遺傳學(xué)
    發(fā)電機(jī)定子繞組極化去極化測試系統(tǒng)設(shè)計(jì)
    電纜等溫松弛電流的時間特性與溫度特性研究
    絕緣材料(2020年9期)2020-09-28 06:46:40
    例析對高中表觀遺傳學(xué)的認(rèn)識
    去極化氧化還原電位與游泳池水衛(wèi)生指標(biāo)關(guān)系研究
    實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)巧斷遺傳學(xué)(下)
    細(xì)說動作電位
    肉豆蔻揮發(fā)油對缺血豚鼠心室肌動作電位及L型鈣離子通道的影響
    去極化電流法對10kV電纜絕緣老化診斷的研究
    醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)PBL教學(xué)法應(yīng)用初探
    表遺傳學(xué)幾個重要問題的述評
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:30
    久久久国产一区二区| 久久久久视频综合| 国产xxxxx性猛交| 美女福利国产在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产又色又爽无遮挡免| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99久久99久久久精品蜜桃| 免费在线观看黄色视频的| 国产极品天堂在线| 成人亚洲欧美一区二区av| av在线老鸭窝| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产成人精品久久二区二区91 | 两个人免费观看高清视频| 97人妻天天添夜夜摸| 两个人看的免费小视频| 国产麻豆69| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲国产日韩一区二区| 韩国精品一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲色图综合在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲精品视频女| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品亚洲成国产av| 少妇 在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线观看国产h片| 七月丁香在线播放| 日韩av不卡免费在线播放| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 无限看片的www在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 男人操女人黄网站| 免费观看人在逋| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久久久人人人人人| 女性被躁到高潮视频| 激情五月婷婷亚洲| 日韩大片免费观看网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 在线观看人妻少妇| 五月天丁香电影| av天堂久久9| 久久精品亚洲av国产电影网| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久性视频一级片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲国产av新网站| 午夜日本视频在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲第一青青草原| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 另类亚洲欧美激情| 亚洲少妇的诱惑av| 一个人免费看片子| 亚洲精品国产区一区二| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲一区中文字幕在线| 美国免费a级毛片| 嫩草影院入口| 激情五月婷婷亚洲| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲综合色网址| 2018国产大陆天天弄谢| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲国产成人一精品久久久| 99热全是精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产精品久久久久久精品古装| 一区二区三区乱码不卡18| av卡一久久| 亚洲国产最新在线播放| 丰满少妇做爰视频| 曰老女人黄片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品视频女| 亚洲av中文av极速乱| 青草久久国产| 国产成人精品无人区| 一级,二级,三级黄色视频| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| e午夜精品久久久久久久| 国产激情久久老熟女| 欧美久久黑人一区二区| 成人影院久久| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲综合精品二区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品久久久精品久久久| 9热在线视频观看99| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品一二三区在线看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品视频人人做人人爽| www.av在线官网国产| 看免费成人av毛片| 啦啦啦 在线观看视频| 国产av精品麻豆| 日韩人妻精品一区2区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 91国产中文字幕| av免费观看日本| 最新在线观看一区二区三区 | 国产av一区二区精品久久| 十八禁网站网址无遮挡| 国产有黄有色有爽视频| 日韩一本色道免费dvd| 香蕉国产在线看| 最近最新中文字幕免费大全7| 夫妻午夜视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 免费av中文字幕在线| 青青草视频在线视频观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲美女视频黄频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品一区在线观看国产| 久久99热这里只频精品6学生| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产老妇伦熟女老妇高清| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲图色成人| 国产xxxxx性猛交| 精品少妇黑人巨大在线播放| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产av精品麻豆| 大话2 男鬼变身卡| 69精品国产乱码久久久| 性少妇av在线| 久久影院123| 一级毛片我不卡| 日韩 亚洲 欧美在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人三级做爰电影| 天堂8中文在线网| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久久久国产精品人妻一区二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 波多野结衣av一区二区av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩av免费高清视频| av国产精品久久久久影院| 高清欧美精品videossex| 妹子高潮喷水视频| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品一二三| 亚洲成人av在线免费| 日韩大码丰满熟妇| 国产 一区精品| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲成人手机| 国产日韩欧美视频二区| 高清在线视频一区二区三区| 午夜福利一区二区在线看| 看十八女毛片水多多多| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 最黄视频免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av国产精品久久久久影院| 日本欧美国产在线视频| 黄色 视频免费看| 人妻 亚洲 视频| 成年人免费黄色播放视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 国产成人精品福利久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av免费观看日本| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日韩精品网址| 极品少妇高潮喷水抽搐| 秋霞伦理黄片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品成人在线| 啦啦啦在线观看免费高清www| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产日韩欧美视频二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 人妻人人澡人人爽人人| 999精品在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品无大码| 亚洲国产av新网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 黄色一级大片看看| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 精品少妇久久久久久888优播| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 中文字幕制服av| 午夜福利,免费看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人妻一区二区av| a级毛片在线看网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 嫩草影院入口| 美女视频免费永久观看网站| 欧美黑人精品巨大| 国产成人精品久久久久久| 少妇人妻久久综合中文| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品第二区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 大陆偷拍与自拍| 亚洲天堂av无毛| 久久综合国产亚洲精品| 97精品久久久久久久久久精品| 日本91视频免费播放| 女人久久www免费人成看片| 国产精品国产三级专区第一集| 大片电影免费在线观看免费| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产伦人伦偷精品视频| 久久性视频一级片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线观看国产h片| 老司机在亚洲福利影院| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲,欧美,日韩| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费不卡黄色视频| 午夜91福利影院| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久久精品人妻al黑| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产高清国产精品国产三级| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕制服av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲天堂av无毛| xxx大片免费视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| kizo精华| 精品一区二区免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久狼人影院| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 久久久久国产一级毛片高清牌| netflix在线观看网站| 黄色 视频免费看| 岛国毛片在线播放| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久精品国产综合久久久| 婷婷成人精品国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产乱来视频区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲成人手机| 中文字幕制服av| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲国产精品999| 欧美精品一区二区大全| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人欧美| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| a级毛片黄视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 午夜av观看不卡| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲专区中文字幕在线 | 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久国产精品麻豆| 国产一区二区 视频在线| av在线老鸭窝| 精品一区二区免费观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 视频区图区小说| 热re99久久精品国产66热6| 国产男女超爽视频在线观看| 色视频在线一区二区三区| 人妻 亚洲 视频| 午夜激情久久久久久久| 涩涩av久久男人的天堂| 极品人妻少妇av视频| 婷婷色av中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久女婷五月综合色啪小说| 热re99久久国产66热| 亚洲国产日韩一区二区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99国产精品免费福利视频| 青春草亚洲视频在线观看| 考比视频在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 秋霞伦理黄片| 丰满乱子伦码专区| 国产不卡av网站在线观看| 夫妻午夜视频| 亚洲精品一二三| 国产片内射在线| 精品一品国产午夜福利视频| 夫妻午夜视频| 国产不卡av网站在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 青春草视频在线免费观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲人成电影观看| 大片免费播放器 马上看| 午夜免费观看性视频| 一区二区av电影网| 秋霞在线观看毛片| 国产一区二区激情短视频 | 精品人妻在线不人妻| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产在线视频一区二区| 少妇的丰满在线观看| 韩国精品一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 乱人伦中国视频| 免费观看a级毛片全部| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 午夜老司机福利片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级爰片在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产激情久久老熟女| 在线观看免费视频网站a站| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品国产av在线观看| av天堂久久9| 亚洲,欧美精品.| 国产视频首页在线观看| 亚洲国产精品999| 国产精品女同一区二区软件| 久久毛片免费看一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美中文综合在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 午夜福利,免费看| 色视频在线一区二区三区| 欧美人与善性xxx| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲成色77777| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久99一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 69精品国产乱码久久久| 乱人伦中国视频| e午夜精品久久久久久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av网站在线播放免费| 午夜福利一区二区在线看| av天堂久久9| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 免费观看性生交大片5| av有码第一页| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美精品一区二区大全| 一区二区三区激情视频| 99热国产这里只有精品6| 嫩草影视91久久| 精品一区二区免费观看| 无遮挡黄片免费观看| 一本色道久久久久久精品综合| 国产xxxxx性猛交| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲国产av影院在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 人妻 亚洲 视频| 欧美精品av麻豆av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 老司机亚洲免费影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品久久久精品久久久| 最近中文字幕2019免费版| 国产成人av激情在线播放| 亚洲第一青青草原| 在线观看免费高清a一片| 成人亚洲欧美一区二区av| 99久国产av精品国产电影| 电影成人av| 久久久精品区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 十八禁高潮呻吟视频| 大码成人一级视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 国产伦人伦偷精品视频| 水蜜桃什么品种好| 欧美精品亚洲一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 不卡av一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 精品少妇内射三级| 欧美激情极品国产一区二区三区| 咕卡用的链子| 伊人亚洲综合成人网| 国产亚洲一区二区精品| 一区二区av电影网| 午夜影院在线不卡| √禁漫天堂资源中文www| 午夜福利一区二区在线看| av一本久久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲四区av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 蜜桃国产av成人99| av片东京热男人的天堂| 午夜福利乱码中文字幕| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲人成77777在线视频| av电影中文网址| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲三区欧美一区| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲伊人色综图| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 新久久久久国产一级毛片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av视频免费观看在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 九草在线视频观看| 我要看黄色一级片免费的| 大话2 男鬼变身卡| 国产片特级美女逼逼视频| 最新的欧美精品一区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产一区二区在线观看av| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 飞空精品影院首页| 国产精品人妻久久久影院| 赤兔流量卡办理| 啦啦啦在线免费观看视频4| 大陆偷拍与自拍| av女优亚洲男人天堂| 国产黄频视频在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲国产精品999| 好男人视频免费观看在线| 一级片免费观看大全| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 精品午夜福利在线看| 久久婷婷青草| av国产精品久久久久影院| 国产熟女欧美一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区| 日韩伦理黄色片| 国产精品久久久av美女十八| 伦理电影免费视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丰满少妇做爰视频| 在线天堂最新版资源| 亚洲五月色婷婷综合| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲图色成人| 亚洲伊人久久精品综合| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一级毛片电影观看| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜福利影视在线免费观看| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 观看av在线不卡| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av电影在线进入| 亚洲,一卡二卡三卡| 99国产精品免费福利视频| 亚洲国产精品一区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧洲日产国产| 精品国产一区二区三区四区第35| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 黑人猛操日本美女一级片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 色吧在线观看| 国产野战对白在线观看| 七月丁香在线播放| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久久精品久久久久真实原创| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产一级毛片在线| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产成人欧美| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 中国国产av一级| 午夜福利免费观看在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 最新的欧美精品一区二区| 最黄视频免费看| 久久婷婷青草| 亚洲成人手机| 只有这里有精品99| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲国产精品一区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一区二区三区激情视频| 日日撸夜夜添| 亚洲,欧美精品.| 欧美乱码精品一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲第一青青草原| 日韩免费高清中文字幕av| av在线观看视频网站免费| 欧美av亚洲av综合av国产av | 99国产综合亚洲精品| 欧美成人午夜精品| 久久久久视频综合| 岛国毛片在线播放| 一级黄片播放器| 国产成人免费观看mmmm| 91精品三级在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 大香蕉久久成人网| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 最近中文字幕高清免费大全6| av.在线天堂| 久久久久久人人人人人| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久国产精品麻豆| 秋霞在线观看毛片| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜影院在线不卡| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 考比视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人国产麻豆网| 亚洲,欧美精品.| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区|