楊芽黃素對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制*

王 瑜, 柯瑞君, 蔣盼若, 應(yīng)佳豪, 樓恩哲, 陳佳玉

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

前列腺癌是危及男性健康的常見(jiàn)疾病之一，在男性惡性腫瘤中的發(fā)病率排名呈持續(xù)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。有研究顯示，美國(guó)2014年前列腺癌發(fā)病率約為100/10萬(wàn)，且預(yù)計(jì)在2018年前列腺癌有新發(fā)病例164 690人，死亡病例為29 430人，將成為最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤[1]。據(jù)2018年中國(guó)國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌以9.8/10萬(wàn)的發(fā)病率取代膀胱癌躍居我國(guó)男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位。目前，現(xiàn)有的化療藥物雖然在一定程度上能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但因副作用太大和易產(chǎn)生腫瘤耐藥性等原因而使治療效果并不理想。因此，高效益、低毒性抗癌新藥的研制已成為前列腺癌治療的必然趨勢(shì)。

楊芽黃素(tectochrysin)為黃酮類(lèi)化合物，它廣泛存在于水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗心腦血管疾病等作用[2-4]。已有研究表明，楊芽黃素除了可通過(guò)使STAT3失活而抑制非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用外[5]，尚可通過(guò)抑制NF-κB通路、增強(qiáng)死亡受體表達(dá)等途徑而具有抗結(jié)腸癌的作用[6]。但目前尚無(wú)有關(guān)該藥是否具有抗前列腺癌的作用及其分子機(jī)制的研究。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞有序主動(dòng)的死亡，在正常人體內(nèi)，細(xì)胞凋亡和抗凋亡一直處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與這種平衡狀態(tài)被打破密切相關(guān)。所以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡一直是腫瘤治療的重要治療策略之一，同時(shí)靶向凋亡信號(hào)通路的藥物研發(fā)也成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)[7,8]。因此本研究將不同劑量的楊芽黃素作用于前列腺癌細(xì)胞22Rv.1，觀察其作用效果，以期發(fā)現(xiàn)治療前列腺癌的新藥并揭示其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

正常前列腺細(xì)胞株RWPE-1和前列腺癌細(xì)胞株22Rv.1為本實(shí)驗(yàn)室所保存。潔凈級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。楊芽黃素來(lái)源于武漢天植生物技術(shù)有限公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)自美國(guó)MedChem Express公司。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶均由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)。AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒和脫脂奶粉源自美國(guó)BD公司。Hoechst 33342、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA裂解液(強(qiáng))由上海Beyotime公司提供。一抗和酶標(biāo)二抗購(gòu)自于武漢BOSTER Biotech公司。PCR各引物由上海Sangon Biotech公司合成。LDH試劑盒購(gòu)自上海Roche Applied Science公司。TRIzol、SuperScript?III First-Strand Synthesis System于美國(guó)Invitrogen公司購(gòu)買(mǎi)。ECL化學(xué)發(fā)光液為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)期的RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞，將細(xì)胞用含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋至5 × 104cells/ml。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取完全培養(yǎng)液稀釋后的RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞于96孔板中以每孔100 μl的接種量接種，在37℃ 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約3 h。待細(xì)胞完全貼壁后，加入楊芽黃素，使其終濃度分別為0、2.5、5、10和20 μg/ml，設(shè)3復(fù)孔，將細(xì)胞在37℃ 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h。待藥物作用結(jié)束后，于每孔加入10 μl CCK8溶液，震蕩混勻后于細(xì)胞孵箱中繼續(xù)孵育3 h，然后用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD值)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)RWPE-1以及22Rv.1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

將完全培養(yǎng)液處理后的RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞以2 ml/well的劑量接種到6孔板中，并將細(xì)胞放置于37℃ 5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，設(shè)三復(fù)孔，分別加入含有0、2.5、5、10和20 μg/ml濃度楊芽黃素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液后，將細(xì)胞繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞用細(xì)胞凋亡(FITC、PE)和細(xì)胞周期(PI)染色試劑盒染色后，最后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和死亡的百分比以及細(xì)胞周期分布的改變，試劑用量和染色方法按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 Hoechst 33342染色法檢測(cè)RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞核型變化

將完全培養(yǎng)液培養(yǎng)稀釋好的RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞以2 ml/well的劑量分別接種于6孔培養(yǎng)板，并將細(xì)胞放置于37℃ 5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，設(shè)三復(fù)孔，分別加入含有0、10和20 μg/ml濃度楊芽黃素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液后，將細(xì)胞繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后取出細(xì)胞，將細(xì)胞進(jìn)行hoechst 33342染色后(試劑用量和染色方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，最后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞核型變化。

1.6 LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)楊芽黃素對(duì)22Rv.1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

分別用0、2.5、5、10和20 μg/ml濃度的楊芽黃素于37℃ 5% CO2條件下作用細(xì)胞融合度為80 %的22Rv.1細(xì)胞，待作用24 h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定LDH水平，試劑用量和實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。并通過(guò)計(jì)算LDH釋放率(%)=培養(yǎng)液中LDH含量 /(培養(yǎng)液中LDH含量+細(xì)胞裂解液中LDH含量)×100%，以分析楊芽黃素對(duì)22Rv.1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

1.7 QPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)22Rv.1細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平

分別用含有0 μg/ml和10 μg/ml楊芽黃素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)22Rv.1細(xì)胞24 h，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Nano Drop2000定量后用SuperScript?III First-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(試劑用量和操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。以β-actin為內(nèi)參，qPCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)trail、p53、dr4、dr5、foxo3、caspase-3、caspase-8、caspase-9、bid、bax、akt、pi3k和bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄水平，qPCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。記錄各基因mRNA的CT值，通過(guò)2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探討楊芽黃素作用后22Rv.1細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)22Rv.1細(xì)胞內(nèi)蛋白的水平

分別取經(jīng)含有0、5、10和 20 μg/ml楊芽黃素的完全培養(yǎng)液作用24 h后的22Rv.1細(xì)胞，用PBS洗3次，1 000 r/min、5 min進(jìn)行離心，離心后完全棄上清，加入適量細(xì)胞裂解液，提取蛋白，經(jīng)蛋白定量試劑盒定量后，選用β-actin為內(nèi)參進(jìn)行Western blot，分析細(xì)胞內(nèi)蛋白TRAIL、P53、DR4、DR5、FOXO3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、BID、BAX、AKT、PI3K和BCL-2的水平，蛋白上樣量為40 μg，各一抗和酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)取試劑說(shuō)明書(shū)建議用量范圍的均值。ECL顯色后，利用Image Quant LAS 4000 mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行圖像采集，通過(guò)photo shop軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度，分析楊芽黃素作用后22Rv.1細(xì)胞內(nèi)蛋白水平和活性的改變。

1.9 抑瘤實(shí)驗(yàn)

取4周齡雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為5組，每組20只。在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞22Rv.1，以1 000 r/min離心5 min，去上清，再用PBS清洗2次(1 000 r/min離心5 min)，取細(xì)胞并用生理鹽水稀釋成5 × 107cells/ml，于每只小鼠的腹股溝處注射0.1 ml細(xì)胞懸液。2 d后，各組分別皮下注射0、1、5、25、125 mg/kg劑量的待測(cè)藥，每隔1 d注射一次，首次注射藥劑的20 d后每組殺10只鼠，取瘤組織稱(chēng)重。記錄每組剩下的10只小鼠的生存時(shí)間，分析該藥的抑瘤作用。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 楊芽黃素對(duì)RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞增殖活性的影響

楊芽黃素(0、2.5、5、10和20 μg/ml)分別作用前列腺癌細(xì)胞22Rv.1和前列腺正常細(xì)胞RWPE-1 0 h、24 h、48 h和72 h。結(jié)果如表1所示，2.5～10 μg/ml楊芽黃素對(duì)22Rv.1細(xì)胞的增長(zhǎng)較正常前列腺細(xì)胞RWPE-1有顯著的抑制作用(P<0.01，n= 3)，并且作用效果隨著用藥劑量和用藥時(shí)間的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)用藥劑量達(dá)到20 μg/ml時(shí)，楊芽黃素在明顯抑制22Rv.1細(xì)胞增殖的同時(shí)也明顯抑制正常前列腺細(xì)胞RWPE-1的增殖，因此，在2.5～10 μg/ml劑量范圍內(nèi)，楊芽黃素可安全有效的用于前列腺癌的治療。

2.2 楊芽黃素對(duì)RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和死亡的影響

分別用0、2.5、5、10和20 μg/ml濃度的楊芽黃素作用RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞24 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如表2所示，楊芽黃素誘導(dǎo)了前列腺癌細(xì)胞22Rv.1凋亡和死亡，且作用效果隨著用藥劑量的增加而增加。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，楊芽黃素用藥劑量在2.5～10 μg/ml范圍內(nèi)，對(duì)正常前列腺細(xì)胞死亡和凋亡率的影響遠(yuǎn)小于對(duì)前列腺癌細(xì)胞22Rv.1的影響。

Tab. 1 The effects of tectochrysin on the proliferation activity of RWPE-1 and 22Rv.1 cells n=3)

*P<0.01vs0 μg/ml group

Tab. 2 The effects of tectochrysin on the apoptosis and death percentage of RWPE-1 and 22Rv.1 cells n=3)

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.3 楊芽黃素對(duì)22Rv.1細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

分別用0 μg/ml和10 μg/ml濃度的楊芽黃素作用于22Rv.1細(xì)胞24 h，PI染色后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析各期細(xì)胞的百分比，結(jié)果如圖1所示，22Rv.1細(xì)胞經(jīng)10 μg/ml楊芽黃素作用后，處于Sub-G1細(xì)胞的比例顯著增加(由0.24 %±0.04%增加到 29.44 %±0.07%，P<0.01，n=3)，G2期細(xì)胞的比例顯著減小(由20.21 %±0.08%減少至3.86 %±0.05%，P<0.01，n=3)。提示楊芽黃素在促進(jìn)22Rv.1細(xì)胞凋亡的同時(shí)可將細(xì)胞阻滯于G2期之前。

Fig.1The cell cycle results detected by flow cytometry(n=3)

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.4 RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞核型變化

RWPE-1和22Rv.1細(xì)胞分別經(jīng)0 μg/ml、10 μg/ml和20 μg/ml濃度的楊芽黃素作用24 h，hoechst 33342染色并通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，22Rv.1細(xì)胞經(jīng)10 μg/ml或20 μg/ml濃度的楊芽黃素作用后，部分細(xì)胞核染色質(zhì)濃集，出現(xiàn)核碎裂和凋亡小體的現(xiàn)象，且發(fā)生核型改變的細(xì)胞比例隨用藥濃度增加而增加，由28 %增加至42 %。在楊芽黃素用藥劑量為10 μg/ml時(shí)，正常前列腺細(xì)胞RWPE-1的細(xì)胞核型無(wú)明顯改變，但當(dāng)用藥劑量達(dá)到20 μg/ml時(shí)，約30 %細(xì)胞的細(xì)胞核亦呈現(xiàn)染色濃集、核碎裂和凋亡小體的核型，因此后面基因和蛋白分析的實(shí)驗(yàn)中，以10 μg/ml楊芽黃素作用濃度作為用藥劑量(圖2)。

Fig.2The results of hoechst 33342 staining

2.5 乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，2.5、5、10和20 μg/ml 楊芽黃素作用于22Rv.1細(xì)胞作用24 h后，乳酸脫氫酶釋放率由未用藥組的0.40%±0.02%增加到5.02%±0.03%、14.13%±0.07%、22.18%± 0.11%和43.31%±0.13%。因此楊芽黃素具有顯著的細(xì)胞毒作用(P<0.01，n= 3)。

2.6 22Rv.1細(xì)胞內(nèi)基因mRNA水平qPCR檢測(cè)結(jié)果

QPCR檢測(cè)結(jié)果表明(表3)，與0 μg/ml楊芽黃素用藥組相比較，10 μg/ml楊芽黃素作用22Rv.1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)基因trail、p53、dr4、dr5、foxo3、caspase-3、caspase-8、caspase-9、bid和bax的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.01，n= 3)，而akt、pi3k和bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。

GenesThe ratio of 2-△△CT (Examination/Control)GenesThe ratio of 2-△△CT (Examination/Control)TRAIL4.32±0.14*p534.63±0.16*DR43.77±0.07*AKT0.38±0.04*DR56.59±0.05*PI3K0.43±0.03*FOXO3a3.45±0.14*Caspase-32.15±0.09*Bid4.32±0.20*Caspase-83.28±0.15*Bax3.26±0.14*Caspase-93.27±0.16*Bcl-20.47±0.04*

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.7 Western blot檢測(cè)22Rv.1細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

22Rv.1細(xì)胞分別經(jīng)0、5、10和20 μg/ml濃度的楊芽黃素作用24 h后，取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平，結(jié)果顯示(表4)，楊芽黃素可促使22Rv.1細(xì)胞內(nèi)TRAIL、P53、DR4、DR5、FOXO3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bid和BAX蛋白的表達(dá)、活化，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白AKT、PI3K和BCL-2的表達(dá)、活化，且作用效果與用藥劑量有關(guān)。

The ratio of protein / β-Actin0 μg/ml5 μg/ml10 μg/ml20 μg/mlTRAIL0.11±0.080.36±0.03*0.52±0.06*0.97±0.02*DR50.07±0.090.28±0.08*0.65±0.07*1.07±0.09*DR40.06±0.050.18±0.06*0.46±0.02*0.88±0.05*Bid0.12±0.090.23±0.09*0.39±0.04*0.95±0.03*Bax0.09±0.110.18±0.06*0.57±0.08*1.07±0.02*Bcl-20.92±0.080.66±0.03*0.35±0.07*0.21±0.07*Caspase-80.01±0.010.14±0.11*0.29±0.10*0.74±0.06*Caspase-30.02±0.010.13±0.08*0.34±0.09*0.67±0.02*Caspase-90.03±0.010.12±0.07*0.32±0.11*0.49±0.09*PI3K1.19±0.070.68±0.06*0.21±0.05*0.15±0.02*AKT0.97±0.050.56±0.04*0.32±0.06*0.23±0.05*p530.04±0.010.17±0.08*0.41±0.09*0.76±0.02*FOXO3a0.05±0.010.27±0.03*0.45±0.06*0.69±0.04*

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.8 抑瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)用藥劑量分別為1、5、25和125 mg/kg時(shí)，腫瘤抑制率分別為28.32%± 0.04%、61.17%±0.07%、72.06%±0.11%和81.29%±0.19%。因此，楊芽黃素可抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)，楊芽黃素用藥后，小鼠的存活期延長(zhǎng)，當(dāng)藥物劑量達(dá)到25 mg/kg時(shí)，小鼠狀態(tài)最好，且其生存期由未用藥的(21.4±0.07)d延長(zhǎng)到(107.2±0.1)d(P< 0.01,n=10)。但當(dāng)藥物劑量增加到125 mg/kg時(shí)，小鼠在用藥18 d即有1只死亡，其余小鼠存活期較藥物濃度為25 mg/kg時(shí)明顯縮短(49.43±0.21 d)。

3 討論

楊芽黃素作為一種植物提取物，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它對(duì)22Rv.1細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用。在楊芽黃素作用后，可以發(fā)現(xiàn)22Rv.1細(xì)胞增殖活性明顯受抑，且細(xì)胞凋亡、死亡的比例明顯增加，細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞核型向凋亡的核型轉(zhuǎn)變。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊芽黃素作用于22Rv.1細(xì)胞不僅促使死亡受體DR4、DR5基因高表達(dá)，而且使Caspase家族中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平明顯上升。Caspase家族與細(xì)胞凋亡途徑密切相關(guān)，其中包括凋亡起始者Caspase-8、Caspase-9，以及凋亡的執(zhí)行者Caspase-3。而已有研究表明TRAIL可以通過(guò)激活Caspase-8來(lái)啟動(dòng)線(xiàn)粒體信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制就是通過(guò)TRAIL黏附于其受體，通過(guò)激活Caspase-8，從而觸發(fā)線(xiàn)粒體途徑，發(fā)出促使腫瘤細(xì)胞凋亡和死亡的信號(hào)[9]。本實(shí)驗(yàn)楊芽黃素作用的信號(hào)通路如圖3所示，TRAIL與DR4、DR5受體結(jié)合，發(fā)出的信號(hào)激活下游蛋白Caspase-8，導(dǎo)致其效應(yīng)物Caspase-3的激活，而Caspase-3使得bax基因與bcl-2基因表達(dá)失去固有的平衡，使得凋亡基因bax占主導(dǎo)地位，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)TRAIL在激活Caspase-8后，還通過(guò)線(xiàn)粒體依賴(lài)的內(nèi)源性通路活化了bcl-2家族中的Bid蛋白，形成有活性的tBid并進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)，線(xiàn)粒體外膜的通透性發(fā)生改變，跨膜電位降低，線(xiàn)粒體內(nèi)的Cytc釋放到胞漿中。來(lái)自線(xiàn)粒體內(nèi)的Cytc在胞漿中可與Apaf1相結(jié)合，促進(jìn)Caspase-9活化，最終同樣使得Caspase-3被激活，通過(guò)影響凋亡基因和抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)22Rv.1細(xì)胞的凋亡。已有研究表明TRAIL在誘導(dǎo)22Rv.1細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)對(duì)于人體正常的細(xì)胞并沒(méi)有明顯的殺傷作用[10]，這使得楊芽黃素通過(guò)TRAIL通路抗前列腺癌具有巨大的研究意義及臨床前景。

有研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路在前列腺癌細(xì)胞中被激活，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，一但PI3K/AKT信號(hào)通路被抑制，前列腺癌的發(fā)展也會(huì)受抑[11-13]。而在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在楊芽黃素作用下，22Rv.1細(xì)胞內(nèi)PI3K和AKT的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平顯著下調(diào)，其通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)22Rv.1細(xì)胞發(fā)生凋亡。且當(dāng)PI3K/AKT通路被楊芽黃素抑制后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO3磷酸化水平增高。FOXO3是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它除可以通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和磷酸化水平來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和死亡外，尚能激活TRAIL通路[14,15]，進(jìn)一步促使22Rv.1細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，楊芽黃素抑制PI3K/AKT信號(hào)通路后，還促進(jìn)其下游基因p53的表達(dá)。p53是腫瘤抑制基因，它不僅在腫瘤發(fā)展中具有重要的作用，在細(xì)胞的衰老死亡過(guò)程中也扮演著重要的角色[16]?；罨膒53能抑制抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)、促進(jìn)凋亡基因bax表達(dá)[17]，致使BAX/BCL-2的比例發(fā)生改變，誘導(dǎo)22Rv.1細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而表現(xiàn)出一定的抗前列腺癌效應(yīng)。

綜上，本研究表明，楊芽黃素可以通過(guò)影響PI3K/AKT和TRAIL信號(hào)通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞22Rv.1凋亡，并且這兩種信號(hào)通路的作用相互聯(lián)系，相互促進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)了楊芽黃素在2.5～10 μg/ml劑量下對(duì)正常前列腺細(xì)胞RWPE-1的影響不大，故使得楊芽黃素可作為一種高效低毒的化療藥物安全有效地應(yīng)用于抗前列腺癌的治療。

Fig.3The signal pathway oftectochrysin effect