蘋(píng)果多酚對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)的作用和機(jī)制*

章書(shū)豪， 邵思銘， 陳方政， 祝 靜， 陳羅薇, 王 恒, 項(xiàng)歆惠， 袁琳波

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院， 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院， 4. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 浙江 溫州 325000 )

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一類以肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高為特點(diǎn)的致命性肺血管疾病，嚴(yán)重的限制了患者的運(yùn)動(dòng)耐受性，且可能會(huì)發(fā)展為心力衰竭、慢性阻塞性肺病等多種心肺疾病[1-2]。肺動(dòng)脈高壓的形成主要和肺血管收縮和重構(gòu)有關(guān)，但是具體發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺動(dòng)脈高壓中細(xì)胞受到炎癥刺激，COX-2的含量上升,引起炎癥部位PEG2、PGI2和PGE1含量增加，導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管炎癥反應(yīng)和組織損傷[4]。在肺動(dòng)脈高壓中使用COX-2抑制劑和下調(diào)前列腺素，能夠調(diào)控血管內(nèi)細(xì)胞活性[5]，因此COX-2可以作為多種抗炎癥藥物靶點(diǎn)。

蘋(píng)果多酚(apple polyphenol，APP)是從蘋(píng)果中提取的次生植物代謝產(chǎn)物，能通過(guò)ros/MAPK/NF-κB通路在抗氧化和抗炎癥中發(fā)揮重要作用[6]。在心血管疾病研究中發(fā)現(xiàn),蘋(píng)果多酚能夠起到緩解動(dòng)脈粥樣硬化[7]，激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，從而改善內(nèi)皮細(xì)胞效應(yīng)，降低肺部血壓[8]。但是目前鮮有研究其在肺動(dòng)脈高壓的作用。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果多酚有助于緩解炎癥反應(yīng)、血管收縮和平滑肌細(xì)胞的增殖作用，從而能夠改善肺動(dòng)脈高壓。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

蘋(píng)果多酚購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，野百合堿(MCT)購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。COX-2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司, eNOS抗體和Abcam購(gòu)自Cell Signaling Technology(Danvers, MA,USA)，PowerLab 4/35(澳大利亞AD Instruments)，生理壓力傳感器(BL—Newcentmry,成都泰盟科技有限公司)，CO檢測(cè)器(ml313C, AD儀器)，NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

實(shí)驗(yàn)采用雄性SD大鼠，體重(180～200 g)，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(20140038)。購(gòu)入后普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飼養(yǎng)間溫度22～25℃, 相對(duì)濕度50%～60%。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院所制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南》，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)審批。大鼠采用隨機(jī)編號(hào)分為四組(Con組，MCT組，APP組，MCT+APP組)，每組9只(1)Con組：大鼠皮下注射生理鹽水，作為對(duì)照組。(2)APP組：隔天按20 mg/kg的劑量腹腔注射蘋(píng)果多酚。(3)MCT組：按60 mg/kg劑量皮下注射MCT。(4)MCT+APP組：皮下注射60 mg/kg劑量MCT,隔天按20 mg/kg劑量腹腔注射APP，所有處理持續(xù)3周[9]。

1.3 大鼠體重與3周存活率的測(cè)定

各組大鼠于處理前和處理后一周、兩周、三周時(shí)分別進(jìn)行稱重，并統(tǒng)計(jì)3周后各組存活大鼠數(shù)量，計(jì)算存活率。

1.4 肺動(dòng)脈動(dòng)力學(xué)測(cè)量

處理三周后，大鼠用3 ml/1 kg的水合氯醛麻醉，暴露右頸外靜脈，行頸外靜脈插管術(shù)，連接血壓壓力換能器至powerlab生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)，對(duì)肺動(dòng)脈壓力(mean pulmonary artery pressure，mPAP)進(jìn)行讀值。用熱稀釋法檢測(cè)心輸出量(cardiac output, CO)，用CO檢測(cè)器(ml313C, AD儀器)處理數(shù)據(jù)。PVR用公式計(jì)算:PVR=mPAP/CO

1.5 右心室肥厚指數(shù)測(cè)量

大鼠處死解剖，將心臟沿著心室邊緣和室間隔將右心室切開(kāi)。用生理鹽水略洗，除去多余心肌組織，用濾紙吸干其表面水分，稱量右心室、左心室、室間隔(left ventricle+ Interventricular septum, LV+S)的重量，右心室肥大指數(shù)計(jì)算公式:RV /(LV + S)×100%。

1.6 肺血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)的組織病理學(xué)觀察

將大鼠肺組織脫水透明，浸蠟包埋，65℃烘箱中烘干，二甲苯中脫蠟兩次，在濃度分別為100%、95% 、90%、80%、70%的酒精中依次浸泡3 min，再經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入蘇木精染色。通過(guò)1%鹽酸乙醇進(jìn)行分化。再將切片用伊紅染色并用蒸餾水洗滌后用70%，85%，95%，100%濃度梯度的乙醇脫水。二甲苯透明化后用中性膠固定。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)，以評(píng)估組織病理學(xué)變化。

1.7 肺動(dòng)脈血管環(huán)外周長(zhǎng)比值(WT%)，肺小血管管壁面積和管總面積比值(WA%)測(cè)量

采用病理圖像分析軟件 Image-pro Plus，測(cè)量肺動(dòng)脈外徑(the diameter of external vessal, ED)，內(nèi)徑(the diameter of internal vessal, ID)和內(nèi)側(cè)壁厚度(medial wall thickness, MWT)。 肺動(dòng)脈介質(zhì)厚度(pulmonary arterial media thickness, PAMT)可以通過(guò)以下公式計(jì)算：PAMT = 2×MWT / ED，計(jì)算壁面積(WA)，總面積(total area, TA)，血管內(nèi)腔面積(lumen area, LA)。計(jì)算WT%公式：WT%= 2×PAMT / ED×100%，計(jì)算WA%公式：WA%=(TA-LA)/ TA×100%。

1.8 通過(guò)Q-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

將各組肺組織樣品剪成小塊后碾磨，加入TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分離出全部RNA。使用GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)將RNA用作模板以產(chǎn)生cDNA合成。用于RT-PCR的引物序列如表1：

Tab. 1 The primer sequences used for RT-PCR

對(duì)于每個(gè)樣品，三次進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)量。

1.9 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)COX-2和eNOS水平

通過(guò)10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，切除肺組織。分離肺主動(dòng)脈，剪開(kāi)動(dòng)脈，內(nèi)膜面貼于培養(yǎng)皿置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱0.5 h后加含15%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，第5日內(nèi)皮細(xì)胞爬出后摘掉除組織塊，取內(nèi)皮細(xì)胞放入EP管中，研磨后加入200 μl細(xì)胞裂解液，再次研磨置于離心機(jī)中14 000g離心15 min，收集上清液。酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，加上樣緩沖液煮沸保存。制備SDS-PAGE凝膠。通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在通過(guò)多克隆抗COX-2(或抗eNOS)檢測(cè)COX-2(或eNOS)后，使用ECL成像系統(tǒng)顯示條紋灰度級(jí)來(lái)測(cè)量COX-2(或eNOS)的含量。

1.10 內(nèi)皮細(xì)胞中NO水平檢測(cè)

內(nèi)皮細(xì)胞分離方法同上，使用NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)來(lái)定量測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO水平，所有測(cè)量均遵循制造商方案進(jìn)行。

1.11 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，分離肺組織中的肺動(dòng)脈，在顯微鏡下剝離肺動(dòng)脈內(nèi)外膜，將肺動(dòng)脈中膜剪為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每4～6 d更換培養(yǎng)液1次(含15%胎牛血清的DMEM/F12)。16 d后細(xì)胞爬出，呈典型峰谷狀分布。經(jīng)抗α-actin單克隆抗體免疫組化鑒定，為純度97%以上的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。經(jīng)胰酶消化傳代培養(yǎng)，采用生長(zhǎng)良好的4～7代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.12 平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +水平檢測(cè)

通過(guò)Becton Dickinson FACS Calibur流式細(xì)胞儀，用Ca2++(-)敏感性熒光染料Fluo-3 /乙酰氧基甲酯(Fluo-3 / AM)測(cè)定平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。使用PerkinElmer LS 55熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值，每1分鐘激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm和526 nm。使用以下等式，用fluo-3熒光強(qiáng)度計(jì)算平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+：[Ca2+] i = Kd [(F-Fmin)/(F max -F)]，其中Kd=400 nmol/L。通過(guò)添加0.1%Triton X-100測(cè)定最大Fluo-3熒光強(qiáng)度(Fmax)，通過(guò)加入5 mmol/L EGTA抑制Fluo-3熒光測(cè)定最小熒光強(qiáng)度(Fmin)。F是在不添加Triton-X-100或EGTA的情況下測(cè)量的熒光值。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的體重和存活率的影響

在建模和治療的3周中，Con組，APP組和APP + MCT組的平均體重增加，而MCT組的平均體重明顯減少。在治療結(jié)束時(shí)，MCT組的平均值低于Con組，APP組和APP + MCT組。 MCT + APP組的存活率高于MCT組，Con組和APP組的100%存活率。結(jié)果表明APP能夠提高大鼠存活率和體重(表2)。

2.2 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)的影響

與Con組和APP組相比，MCT組的mPAP和PVR顯著增加(P<0.05)，這意味著成功建立PAH模型。 與MCT組相比，MCT + APP組的mPAP和PVR顯著降低(P<0.05)，顯示APP在治療MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠有顯著作用。APP組與Con組結(jié)果相同，說(shuō)明APP無(wú)明顯副作用(表3)。

2.3 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室重塑的影響

與Con組和APP組相比，MCT組的RVHI顯著升高(P<0.05)。與MCT組相比，MCT + APP組的RVHI顯著降低(P<0.05)，表明APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室肥大有抑制作用(表3)。

Tab. 2 Effects of APP on body weight and survival rate of MCT-induced PAH rats (g, n=9)

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

GroupmPAPΔPVRRVHICon15.84±2.48213.37±30.290.17±0.03APP15.09±1.49212.93±27.980.16±0.03MCT56.49±7.71**698.68±80.69**0.50±0.09**APP+MCT39.53±8.85##498.59±115.32##0.35±0.10#

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

2.4 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動(dòng)脈重構(gòu)的影響

組織鏡檢結(jié)果顯示Con組和APP組肺動(dòng)脈壁平滑且內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)，平滑肌細(xì)胞無(wú)異常增厚現(xiàn)象，大多數(shù)肺泡壁完整。MCT組內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺動(dòng)脈中層有10～15層的平滑肌，血管出現(xiàn)明顯增厚和重構(gòu)現(xiàn)象。在MCT + APP組中，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)完整，動(dòng)脈中層8～12層平滑肌APP治療緩解了MCT對(duì)肺組織的結(jié)構(gòu)破壞，抑制了平滑肌細(xì)胞增厚(圖1A)。 MCT組的WT% (40.87%±7.58%)和WA%(82.00%±11.80%)顯著高于Con組的WT%(13.93%±3.00%)和WA%(59.00%±10.90%，P<0.05，圖1B和C)，MCT + APP組的WT%(25.36%±4.51%)和WA% (66.00%±10.90%)顯著低于MCT組(P<0.05，圖1B和C))，結(jié)果表明APP能夠緩解MCT誘導(dǎo)的血管重構(gòu)。

2.5 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織COX-2 和炎癥因子表達(dá)的影響

MCT組中MPO ,IL-1 ,IL-6 ,TNF-α表達(dá)顯著高于Con組和APP組中的炎性因子表達(dá)(P<0.05，圖2A，B和C)。 APP可緩解MCT引起的肺組織炎癥，因?yàn)镸CT + APP組MPO ,IL-1,IL-6 ,TNF-α表達(dá)明顯低于MCT組(P<0.05，圖2A，B和 C)。MCT組的COX-2表達(dá)(3.483±0.671)顯著高于Con組中的表達(dá)，而MCT + APP組的COX-2表達(dá)(1.815± 0.215)顯著低于MCT組(P<0.05，圖2E)，結(jié)果表明APP能夠抑制炎癥反應(yīng)。

Fig.1The effects of APP on the morphological and structural changes of pulmonary arterioles in the rats

A: Results of HE staining in rat lung tissue(× 200) ; B: Percentage of wall thickness to vascular diameter (WT%); C: Percentage of wall area to total vascular area (WA%).n=9

*P<0.05,**P<0.01vsMCT group

Fig.2The effects of APP on the expressions of MPO, IL-1, IL-6, TNF-α and COX-2 in the lung tissues(n=9)

A,B,C,D: Qrt-PCR results of MPO, IL-1, IL-6 and TNFα expressions in rats; E: Western blot results of COX-2 expression

*P<0.05,**P<0.01vsMCT group

2.6 APP對(duì)肺內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS表達(dá)及NO合成和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度的影響

MCT組的肺內(nèi)皮細(xì)胞NO合成水平(26.887±9.897)μmol/ L顯著低于Con組和APP組(55.777±9.823)μmol/ L(P<0.05，圖3A)。與MCT組相比，MCT + APP組肺內(nèi)皮NO合成水平(42.161± 3.948)μmol/ L明顯升高(P<0.05，圖3A)。同時(shí)，四組eNOS表達(dá)量顯示出同樣的結(jié)果。MCT組的eNOS表達(dá)(0.234±0.0705)顯著低于Con組(P< 0.05，圖3B)，MCT + APP組(0.545±0.154)顯著高于MCT組(P<0.05，圖3B)。MCT刺激和APP治療也引起了四組細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度差異。MCT組的平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度顯著高于Con組和APP組(P<0.05，圖3C和D)。與MCT組相比，MCT + APP組顯著降低(P<0.05，圖3C和D)。這些結(jié)果表明APP可以緩解MCT造成的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)下調(diào)的效應(yīng)，同時(shí)可以降低肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

Fig.3The effects of APP on the protein expression of eNOS and concentration of NO in endothelial cells and Ca2 +in pulmonary artery smooth muscle cells(n=9)

A: NO synthesis ofendothelial cells; B: eNOS expression of endothelial cells; C: The curves of intracellular Ca2+concentration varying along with time; D: Intracellular Ca2+concentration levels differed in pulmonary arterial smooth muscle cells

*P<0.05,**P<0.01vsCon group

3 討論

肺血管的收縮和重構(gòu)是各種病理類型肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的共同環(huán)節(jié)[10]。目前研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)會(huì)引起肺血管收縮和重構(gòu)的產(chǎn)生。一方面炎癥因子的過(guò)度表達(dá)會(huì)改變平滑肌細(xì)胞內(nèi)代謝通路關(guān)鍵酶的含量，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖，血管腔狹窄，導(dǎo)致肺血管阻力升高[11]。另一方面炎癥因子的釋放，白細(xì)胞的聚集誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷和凋亡，上調(diào)平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +[12]。胞漿內(nèi)游離的Ca2 +[(Ca2 +)i]是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)收縮，分化和增殖的關(guān)鍵作用因子，Ca2 +上調(diào)會(huì)導(dǎo)致血管重構(gòu)的發(fā)生[13]，兩者相互作用導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成。同時(shí)，COX-2作為COX家族的同工酶，其在正常細(xì)胞中的含量極低。但在炎癥因子的刺激下，COX-2會(huì)過(guò)度表達(dá)并上調(diào)炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵酶含量和活性。因此COX-2是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵指標(biāo)[14]。COX-2也被認(rèn)為是抗炎藥物的治療靶點(diǎn)[15]。

蘋(píng)果多酚是一種提取自蘋(píng)果的多酚類物質(zhì)，以往研究發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抗炎活性[15]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果多酚不僅可以通過(guò)抑制炎癥因子COX-2和IL-1，IL-6，TNF-α，MPO 的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)和血管壁內(nèi)白細(xì)胞聚集。還可以通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成eNOS，釋放NO，起到緩解血管收縮和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。保持血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的完整，能夠通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，胞間信號(hào)傳導(dǎo)降低平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +含量，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，從而逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，改善血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。此外，還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果多酚能夠通過(guò)NF-κB通路減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[16]，介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，于在心血管疾病中，蘋(píng)果多酚還能夠通過(guò)抑制ox-LDL誘導(dǎo)MAPK的激活預(yù)防早期動(dòng)脈粥樣硬化[17]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果多酚主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)NO和Ca2 +，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，來(lái)逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)過(guò)程，并且沒(méi)有副作用。目前還有研究指出蘋(píng)果多酚能夠通過(guò)代謝途徑和其他炎癥通路，抑制肺平滑肌細(xì)胞增殖，但具體機(jī)制尚不清楚，仍有待研究。但其是天然植物提取物，易提取純化，且無(wú)明顯毒副作用，具有良好的廣泛應(yīng)用前景。