二甲雙胍抑制JNK改善縫隙連接功能緩解骨癌痛的實(shí)驗(yàn)研究

谷宇峰，潘秀秀，宋 玲，楊 星，胡 亮，劉文濤

(南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省神經(jīng)退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210029)

臨床上大約64%以上的腫瘤晚期或者轉(zhuǎn)移癌患者都會(huì)面臨疼痛問(wèn)題[1]。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到骨組織，通過(guò)釋放致痛物質(zhì)引起骨內(nèi)部神經(jīng)纖維的敏化和激活，從而產(chǎn)生疼痛，稱為骨癌痛(bone cancer pain，BCP)[2]。轉(zhuǎn)移性乳腺、結(jié)腸或肺癌的患者中都容易出現(xiàn)骨癌痛，這種疼痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，當(dāng)前并沒(méi)有令人滿意的臨床解決方案。

有文獻(xiàn)指出[3-4]，癌痛過(guò)程中膠質(zhì)細(xì)胞包括小膠質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)明顯的活化。但與神經(jīng)病理性疼痛有所差異：癌痛中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化相比于小膠質(zhì)細(xì)胞更加強(qiáng)烈而持久。近來(lái)有報(bào)道[4-6]證明，抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化能夠有效地改善慢性痛和骨癌痛。星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在腫瘤細(xì)胞植入(tumor cell implantation，TCI)引起的骨癌痛的維持中發(fā)揮了重要作用[7]。但是，要合理高效地抑制癌痛中星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能紊亂，目前并沒(méi)有很好的治療手段。

星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞不同，除了促進(jìn)炎癥以外，另一個(gè)很重要的功能在于為周圍的神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)和支持。而這一功能主要由縫隙連接(gap junction)，即將相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行連接的細(xì)胞內(nèi)通道所介導(dǎo)。許多報(bào)道都證明了縫隙連接在慢性疼痛中發(fā)揮重要作用，就此展開(kāi)的研究不在少數(shù)[8-9]。然而，在癌痛尤其是骨癌痛模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接的影響，迄今沒(méi)有得到很好的研究和闡述。由此，本課題組提出設(shè)想，是否可以通過(guò)特定的手段來(lái)調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接即支持營(yíng)養(yǎng)功能，并由此改善骨癌痛。

本課題組前期研究[10]發(fā)現(xiàn)，在TCI的骨癌痛模型中，激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]能抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化緩解神經(jīng)炎癥從而改善疼痛。本研究中，通過(guò)鞘內(nèi)注射(i.t.)AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍，評(píng)估對(duì)大鼠TCI引起的骨癌痛是否有良好鎮(zhèn)痛作用，開(kāi)發(fā)老藥的新用途，并初步探索其中的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

鹽酸二甲雙胍、縫隙連接抑制劑carbenoxolone(CBX)、AMPK抑制劑Compound C(CC)、Tris(德國(guó)Sigma公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國(guó)Sigma公司)；縫隙連接蛋白Connexin 43(Cx43)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(美國(guó)CST公司)；鈣離子綁定銜接分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1，IBA-1)抗體(美國(guó)Abcam公司)；JNK抑制劑SP600125(美國(guó)MCE公司)；AMPK激動(dòng)劑acadesine(5-aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside，AICAR)、細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；30% Acrylamide/Bis(美國(guó)Bio Rad公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)(南京生興生物技術(shù)有限公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、TBST緩沖液、甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)；驢血清(美國(guó)Millipore公司)；驢抗兔熒光二抗、驢抗鼠熒光二抗(美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 儀 器

Kontes組織勻漿器(德國(guó)IKA公司)；TE 124s電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀、Microcll7R冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Mini Protean4電泳儀、Mini Protean4轉(zhuǎn)膜儀、Quantity One 4.6.5分析軟件(美國(guó)Bio Rad公司)。

1.3 動(dòng) 物

雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重180～220 g[上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)：20130016009092，使用許可證號(hào)：SCXK(蘇)2013-0016]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于12 h晝夜交替的獨(dú)立環(huán)境中，室溫維持在25±1 ℃，自由飲水和攝食，在適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。對(duì)動(dòng)物的所有處理均遵循國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)倫理委員會(huì)的要求。

2 方 法

2.1 骨癌痛模型建立

將Walker256腹水腫瘤細(xì)胞懸液(每毫升5×106個(gè)細(xì)胞)0.5 mL腹腔注射到大鼠體內(nèi)，接種7 d后，從動(dòng)物腹腔中抽取單細(xì)胞懸液。參照文獻(xiàn)[11]的方法建立骨癌痛模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為以下幾組：正常對(duì)照組；TCI組；TCI+SP600 125(10 μg，i.t.)；TCI+SP600125(10 μg，i.t.)+CBX(10 μg，i.t.)；TCI+二甲雙胍治療組(50，100 μg，i.t.)；TCI+二甲雙胍(100 μg，i.t.)+CBX(10 μg，i.t.)組。給藥方式：造模14 d后，提前30 min 給予抑制劑(SP600125或CBX)再鞘內(nèi)注射二甲雙胍溶液。用戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定，消毒，大鼠的左膝關(guān)節(jié)用手術(shù)刀切開(kāi)，將含腫瘤細(xì)胞(每毫升1×105個(gè)細(xì)胞)的PBS溶液5 μL直接注射到股骨遠(yuǎn)端的髓腔中。注射產(chǎn)生的小孔用銀汞合金封住，防止腫瘤細(xì)胞從骨頭中流出。

2.2 檢測(cè)骨癌痛模型誘導(dǎo)的機(jī)械痛閾

采用足底測(cè)試儀來(lái)觀測(cè)大鼠機(jī)械痛閾，具體如下:在溫度為20～25 ℃的安靜環(huán)境中，將大鼠置于透明的金屬網(wǎng)格籠內(nèi)，測(cè)量前使之預(yù)適應(yīng)20 min，當(dāng)探覓行為停止則開(kāi)始測(cè)量。用足底測(cè)試儀的平鈍針尖剌激大鼠足底，從無(wú)壓力逐漸緩慢加壓，直至動(dòng)物產(chǎn)生縮足反應(yīng)，每次測(cè)量間隔3 min，大鼠足爪抬起時(shí)對(duì)應(yīng)的最小壓力為其機(jī)械性剌激縮足反射閾值。每只大鼠至少平行測(cè)量3次。

2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取大鼠脊髓L4-L6節(jié)段，按一定比例加入細(xì)胞裂解液，處理樣品，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，10%牛奶封閉液室溫封閉2 h，加入p-JNK一抗(1∶1 000)，4 ℃搖晃過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min，顯色。以GAPDH(1∶5 000)為內(nèi)參。采用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

動(dòng)物深度麻醉后，先用PBS隨后換成4%多聚甲醛心臟灌注，之后分離腰椎L4～L5節(jié)段，浸泡在4%多聚甲醛中固定4 d，40%蔗糖脫水7 d。冷凍切片時(shí)每片厚度設(shè)定為20 μm。每組的脊髓切片在4 ℃條件下孵育GFAP，IBA-1，p-Cx43對(duì)應(yīng)一抗(均為1∶100)過(guò)夜，PBS清洗切片后，室溫下避光孵育二抗2 h，再用PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié) 果

3.1 大鼠TCI骨癌痛模型脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化且縫隙連接功能降低

TCI造模14 d后，Von Frey機(jī)械痛檢測(cè)結(jié)果顯示：大鼠的機(jī)械痛閾值明顯下降，癌痛造模成功(圖1-A)。大鼠脊髓L4-L6節(jié)段的免疫熒光結(jié)果顯示，骨癌痛大鼠脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞(用GFAP標(biāo)記)有明顯激活，研究表明，CX43的磷酸化水平與縫隙連接功能呈負(fù)相關(guān)，免疫熒光結(jié)果(圖1-C)提示，TCI造模后大鼠脊髓CX43的磷酸化水平明顯增加(綠色熒光強(qiáng)度明顯增加)，提示縫隙連接功能降低。

3.2 JNK-縫隙連接功能在骨癌痛模型中的作用

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨癌痛大鼠脊髓中p-JNK水平顯著上升(圖2-A)；JNK抑制劑SP600125(10 μg，i.t.)能緩解TCI大鼠的骨癌痛，且該作用能被縫隙連接阻斷劑CBX(10 μg，i.t.)所取消(圖2-B)。由此說(shuō)明，JNK-縫隙連接功能在骨癌痛的形成中發(fā)揮重要作用，阻斷其功能發(fā)揮能有效地緩解TCI引起的大鼠骨癌痛。

3.3 二甲雙胍鞘內(nèi)注射能夠緩解TCI引起的骨癌痛

TCI造模14 d后，給予大鼠二甲雙胍(50，100 μg，i.t.)，有良好的鎮(zhèn)痛效果，尤其100 μg劑量下鎮(zhèn)痛作用明顯(圖3-A)。同時(shí)，大鼠脊髓切片免疫熒光檢測(cè)顯示，二甲雙胍100 μg能夠顯著地抑制TCI造模后GFAP和IBA-1的活化(圖3-B)。

3.4 二甲雙胍對(duì)骨癌痛的鎮(zhèn)痛作用依賴于縫隙連接功能

在TCI引起的骨癌痛模型上，二甲雙胍(100 μg，i.t.)的鎮(zhèn)痛效果被縫隙連接抑制劑CBX(10 μg，i.t.)和AMPK抑制劑CC(10 μg，i.t.)提前30 min預(yù)處理所抑制(圖4-A)。大鼠脊髓樣品Western blot檢測(cè)表明，二甲雙胍降低了脊髓p-JNK的表達(dá)水平，而AMPK抑制劑CC則減弱了二甲雙胍對(duì)p-JNK的影響(圖4-B)。

Figure1 Tumor cell implantation (TCI) bone cancer pain activated astrocytes and inhibited gap junction in the spine of rat

Figure2 Important role of JNK-gap junction pathway in TCI-induced bone cancer pain

A:TCI significantly increased the expression of p-JNK in the spine of TCI rat；B:JNK inhibition attenuated TCI-induced bone cancer pain,which was abolished by gap junction inhibitor in rats

***P<0.001vscontrol group；###P<0.001vsTCI group;&P<0.05,&&&P<0.001vsTCI+SP600125 group

Figure3 Metformin alleviated bone cancer pain caused by TCI in rats

***P<0.001vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vsTCI group

Figure4 Analgesic effect of metformin on the bone cancer pain model is dependent on the AMPK-JNK-gap junction pathway

**P<0.01,***P<0.001vscontrol group；#P<0.05,###P<0.001vsTCI group；&P<0.05,&&&P<0.001vsTCI + Met group

4 討 論

目前，疼痛已經(jīng)成為繼體溫、脈搏、呼吸、血壓之后的第5大生命體征[11]，日益受到重視。骨癌痛是腫瘤患者較為常見(jiàn)且十分劇烈的一種傷害性疼痛。遺憾的是，臨床上常用的藥物都無(wú)法取得令人滿意的治療效果。因此，尋找新的潛在治療靶點(diǎn)和藥物對(duì)于提高骨癌痛患者的生活質(zhì)量而言，是非常有必要的。

骨癌痛的形成機(jī)制較為復(fù)雜，目前，經(jīng)過(guò)相關(guān)學(xué)者們的研究[12-13]，中樞敏化被認(rèn)為是重要機(jī)制之一。在中樞敏化機(jī)制中，許多報(bào)道都證明了脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在骨癌痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要的作用[14-15]。星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)縫隙鏈接為其他神經(jīng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)并開(kāi)展細(xì)胞間通訊。所謂縫隙連接，是指將相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行連接的細(xì)胞內(nèi)通道，由相鄰細(xì)胞膜上的兩個(gè)連接子(connexon)互相錨定而構(gòu)成，連接子則是由六個(gè)亞單位-連接蛋白(connexin/Cx)組成。大量研究[16-17]表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接在慢性神經(jīng)病理性疼痛中扮演著至關(guān)重要的角色。本研究發(fā)現(xiàn)，TCI引起的骨癌痛大鼠脊髓中，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量激活而縫隙連接功能(與p-Cx43水平成反比)卻明顯減弱，且縫隙連接阻斷劑CBX對(duì)骨癌痛大鼠的機(jī)械痛覺(jué)的行為學(xué)表現(xiàn)有重要影響。本研究首次證明星形膠質(zhì)細(xì)胞上的縫隙連接也參與了骨癌痛的形成，骨癌痛模型下縫隙連接功能明顯受阻。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是哺乳類細(xì)胞MAPK(mitogen-activated protein kinase，絲裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路的一個(gè)亞類。在慢性疼痛中，通常伴隨著JNK信號(hào)通路的激活[18]。抑制JNK通路能緩解骨癌痛也在不少報(bào)道中被證明[19-20]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在多種腫瘤模型中都發(fā)現(xiàn)JNK通路和縫隙連接存在著密切的相關(guān)關(guān)系[16]。因此，在本研究考察了骨癌痛模型下JNK通路和縫隙連接的相互關(guān)系。結(jié)果顯示，骨癌痛造模成功的大鼠脊髓中p-JNK和p-Cx43的蛋白水平都明顯升高；JNK抑制劑SP600125能夠顯著抑制TCI造成的骨癌痛，而這種鎮(zhèn)痛效果幾乎完全被縫隙連接阻斷劑CBX所抑制。本研究結(jié)果說(shuō)明，JNK-縫隙連接功能在骨癌痛中有重要作用，可能成為解決骨癌痛這一難題的新治療靶標(biāo)。

AMPK即AMP依賴的蛋白激酶，與膽固醇的生物合成密切相關(guān)，是重要的代謝調(diào)節(jié)蛋白[21]。本課題組之前的研究[22]證明，在脊髓膠質(zhì)細(xì)胞中激活A(yù)MPK能夠有效緩解TCI造成的骨癌痛。因此，本研究試圖探索AMPK對(duì)于骨癌痛的治療效果是否與上述的JNK-縫隙連接功能有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍能有效緩解大鼠TCI引起的骨癌痛，這種明顯的鎮(zhèn)痛效果能被AMPK阻斷劑CC以及縫隙連接阻斷劑CBX所抑制。且Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示，二甲雙胍給藥后，大鼠脊髓JNK的激活則被抑制，這種抑制可被AMPK抑制劑CC所阻斷。本研究首次發(fā)現(xiàn)，AMPK-JNK-縫隙連接功能在骨癌痛生成中具有重要作用，通過(guò)給予二甲雙胍能有效地緩解骨癌痛，為臨床攻克骨癌痛提供了重要的線索。

綜上所述，二甲雙胍通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中JNK改善縫隙連接功能，顯著緩解腫瘤細(xì)胞移植誘導(dǎo)的大鼠骨癌痛。本研究首次在骨癌痛模型下，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中AMPK-JNK-縫隙連接功能的重要作用。本研究為臨床骨癌痛的治療提供了一種潛在的安全有效的藥物，并提出了通過(guò)抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK改善縫隙連接，進(jìn)而改善骨癌痛的潛在治療策略。