藿香正氣制劑中和厚樸酚及總多糖快速測定分析

朱俊平 梁慧慧 文雯 毛妍 范詩琪 劉文龍 賀福元 張喜利

摘要：目的 ?建立HPLC雙波長指紋圖譜快速測定藿香正氣制劑中和厚樸酚含量的方法，建立糖量計法快速測定其總多糖含量的方法，并分析其差異性。方法 ?HPLC采用XB-C18（HS）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈和0.1%磷酸水溶液等度洗脫，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長294、270 nm，柱溫30 ℃;糖量計法以50%乙醇為陰性對照;聚類分析重復(fù)性樣品，對比不同指標(biāo)間的聚類結(jié)果。結(jié)果 ?HPLC測得和厚樸酚在1.40～0.14 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，線性方程為A=12 182 633C-217 418，r?=0.999 5;藿香正氣水中和厚樸酚濃度為（0.400 8±0.005 0）mg/mL，藿香正氣滴丸中其濃度為（0.487 9±0.008 9）mg/mL?？偠嗵窃?.91～0.29 g/mL范圍內(nèi)與其百分值線性關(guān)系良好，線性方程為Y=51.949X+0.868，r2=0.999 9;藿香正氣水中總多糖濃度為（0.31±0.003）g/mL，藿香正氣滴丸中其濃度為（1.12±0.005）g/mL。聚類分析篩選出和厚樸酚峰面積和總多糖百分值作為表現(xiàn)藿香正氣水和藿香正氣滴丸間差異的指標(biāo)。結(jié)論 ?本研究建立的HPLC及糖量計法能有效用于藿香正氣制劑多類指標(biāo)的質(zhì)量控制及不同劑型間的差異考察;聚類分析篩選出的峰面積和總多糖百分值作為評價指標(biāo)具有代表性和準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：藿香正氣水;藿香正氣滴丸;高效液相色譜法;和厚樸酚;總多糖;快速測定;聚類分析

中圖分類號：R284.1 ???文獻標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0078-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.017 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To establish a method for rapid determination of honokiol in Huoxiang Zhengqi Preparations by HPLC dual-wavelength fingerprint， and to establish a sugar meter for rapid determination of total polysaccharide in Huoxiang Zhengqi Preparations， and to analyze its differences. Methods HPLC was performed on an XB-C18 （HS） column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid aqueous solution for isocratic elution. The flow rate was 1.0 mL/min; the injection volume was 20 μL; the detection wavelength was 294 and 270 nm; the column temperature was 30 ℃. Sugar meter method was performed with 50% ethanol as negative control. Cluster analysis was conducted to analyze repeated samples and comparison of clustering results among different indexes. Results The linear relationship between the concentration of honokiol and the peak area in the range of 1.40–0.14 mg/mL was good by HPLC. The linear equation was A=12 182 633C-217 418， r2=0.999 5. The concentration of honokiol in Huoxiang Zhengqi Liquid was （0.400 8±0.005 0）mg/mL; the concentration of honokiol in Huoxiang Zhengqi Dropping Pills was （0.487 9±0.008 9）mg/mL. The linear relationship between the concentration of total polysaccharide and its percentage was good in the range of 0.91–0.29 g/mL; the linear equation was Y=51.949X+ 0.868， r2=0.999 9. The concentration of total polysaccharide in Huoxiang Zhengqi Liquid was （0.31±0.003）g/mL; the total polysaccharide in Huoxiang Zhengqi Dropping Pills was （1.12±0.005）g/mL. The area of honokiol peak and the percentage of total polysaccharide as indicators of Huoxiang Zhengqi Liquid and Huoxiang Zhengqi Dropping Pills showed significant differences between different formulations. Conclusion Established HPLC and sugar meter method can be effectively used for the quality control and investigation of differences between different dosage forms of Huoxiang Zhengqi Preparations; the selected peak area and total polysaccharide percentage as the evaluation index are representative and accurate.

Keywords： Huoxiang Zhengqi Liquid; Huoxiang Zhengqi Dropping Pills; HPLC; honokiol; total polysaccharide; rapid determination; cluster analysis

藿香正氣處方出自北宋《太平惠民和劑局方》，由蒼術(shù)、姜制厚樸、陳皮、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油、紫蘇葉油組成，具有解表化濕、理氣和中功效，用于外感風(fēng)寒、夏傷暑濕或內(nèi)傷濕滯所致的感冒[1]。該方初以散劑形式用于臨床，隨著現(xiàn)代中藥制劑的發(fā)展，為滿足便服、便攜的需求，已逐漸發(fā)展為多種劑型[2-6]，尤以藿香正氣水和藿香正氣滴丸應(yīng)用廣泛[7-8]，生產(chǎn)廠家較多，故制劑質(zhì)量控制尤為重要。目前中藥質(zhì)量控制方法主要包括感官評價、生物評價、化學(xué)評價、基因檢測等方法，以液相、氣相、薄層色譜及質(zhì)譜等方法建立指紋圖譜的化學(xué)評價為主，但這只是小分子化合物成分的分析，不能全面反映中藥所含成分[9]，且對糖類等大分子有效成分研究較少。此外，從“湯者蕩也，去大病用之;丸者緩也，舒緩而治之也”，“甘者緩也”等可以看出，中藥的療效與其劑型和工藝密切相關(guān)，且與其糖含量有關(guān)。因此，本研究以小分子化合物及總糖含量作為評價指標(biāo)用于質(zhì)量控制和不同劑型間的差異考察，建立在15 min內(nèi)同時測定2種藿香正氣制劑中和厚樸酚含量及總多糖含量的方法，并多類指標(biāo)比較分析其差異性，以實現(xiàn)快速、直觀、有效的質(zhì)量控制，達到多類指標(biāo)控制不同劑型藿香正氣制劑的質(zhì)量，并為不同劑型“蕩”與“緩”療效差異提供依據(jù)。

1 ?儀器與試藥

Waters1525液相色譜儀（Waters公司），H1850R臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），KQ5200DE型數(shù)控超聲波震蕩儀（上?？茖W(xué)超聲儀器有限公司），YD601N型電子天平（上海恒平科技儀器有限公司），YP1002N型電子天平（上海菁海儀器有限公司），WYT-4型手持糖量計（中外合資中友光學(xué)儀器有限公司），EKUP-11-20T超純水機（長沙市科臨電子科技有限公司）。

藿香正氣水（湖南漢森制藥股份有限公司，批號171103）;藿香正氣滴丸（天士力制藥集團股份有限公司，批號180116）;和厚樸酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號0730-9204）;蔗糖（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20080214）;乙腈、甲醇為色譜純（TEDIA）;磷酸、無水乙醇為分析純。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?儀器條件

2.1.1 ?色譜條件

色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（HS）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈（25∶75），等度洗脫15 min，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長294、270 nm。

2.1.2 ?糖量計法測定條件

在標(biāo)準(zhǔn)溫度20 ℃條件下，以純化水為空白調(diào)整折光率至0%，取蔗糖對照品和供試品溶液，以50%乙醇為陰性對照，點樣進行測定。

2.2 ?對照品溶液的制備

2.2.1 ?和厚樸酚對照品溶液

精密稱取和厚樸酚對照品14.0 mg，加甲醇溶解定容至5 mL，即得2.8 mg/mL的和厚樸酚貯備液。精密量取和厚樸酚貯備液1 mL，加甲醇定容至10 mL，超聲脫氣，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得0.28 mg/mL的和厚樸酚對照品溶液。

2.2.2 ?蔗糖對照品溶液

精密稱取蔗糖20.0 g，加純化水20 mL，溶解，即得1.0 g/mL的蔗糖貯備液。精密量取蔗糖貯備液1 mL，加純化水1 mL，搖勻，即得0.5 g/mL的蔗糖對照品溶液。

2.3 ?供試品溶液的制備

2.3.1 ?色譜法供試品溶液

取藿香正氣水10 mL，12 000 r/min離心10 min，取上層溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，超聲，即得藿香正氣水HPLC供試品溶液。

取藿香正氣滴丸2.6 g，碾碎，精密加入50%乙醇10 mL，密塞，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）40 min，靜置過夜，12 000 r/min離心10 min，取上層溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，超聲，即得藿香正氣滴丸HPLC供試品溶液。

2.3.2 ?糖量計法供試品溶液

取藿香正氣水10 mL，超聲10 min使沉淀物溶解，搖勻，即得藿香正氣水糖量計法供試品溶液。

取藿香正氣滴丸2.6 g，碾碎，精密加入50%乙醇10 mL，密塞，超聲40 min，靜置過夜，移取上層溶液，即為藿香正氣滴丸糖量計法供試品溶液。

2.4 ?空白溶劑考察

2.4.1 ?色譜法

取50%乙醇，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果表明溶劑對和厚樸酚含量測定無干擾。

2.4.2 ?糖量計法

取50%乙醇，按“2.1.2”項下糖量計法測定條件點樣分析，結(jié)果表明溶劑無干擾。

2.5 ?線性關(guān)系考察

2.5.1 ?色譜法

精密量取25 μL和厚樸酚貯備液6份，分別精密加入甲醇25、75、100、142、225、420 μL，搖勻，即得1.40、0.70、0.56、0.42、0.28、0.14 mg/mL的和厚樸酚對照品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，以色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得和厚樸酚濃度在1.40～0.14 mg/mL范圍內(nèi)的線性方程為A=12 182 633C-217 418，r?=0.999 5。

2.5.2 ?糖量計法

精密量取1 mL蔗糖貯備液6份，分別精密加入純化水100、500、1000、1500、2000、2500 μL，搖勻，即得0.91、0.67、0.50、0.40、0.33、0.29 g/mL的蔗糖對照品溶液，并按“2.1.2”項下糖量計法條件進行測定，以百分值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得蔗糖濃度在0.91～0.29 g/mL范圍內(nèi)的線性方程為Y=51.949X+0.868，r?=0.999 9。

2.6 ?精密度試驗

2.6.1 ?色譜法

取“2.2.1”項下和厚樸酚對照品，按“2.1.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，進樣量20 μL，和厚樸酚峰面積RSD=1.09%，表明HPLC儀器精密度良好。

2.6.2 ?糖量計法

取“2.2.2”項下0.5 g/mL的蔗糖對照品溶液，按“2.1.2”項下糖量計法測定條件重復(fù)點樣6次，每次3滴，結(jié)果蔗糖百分值RSD=0.38%，表明糖量計法精密度良好。

2.7 ?重復(fù)性試驗

2.7.1 ?色譜法

取藿香正氣水和藿香正氣滴丸的同一批樣品各6份，按“2.3.1”項下方法制備HPLC供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，藿香正氣水中和厚樸酚峰面積RSD=1.16%，藿香正氣滴丸中和厚樸酚峰面積RSD=0.85%，表明HPLC方法重復(fù)性均良好。

2.7.2 ?糖量計法

取藿香正氣水和藿香正氣滴丸的同一批樣品各6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，以純化水為空白，按“2.1.2”項下糖量計法測定條件點樣分析，藿香正氣水中總多糖RSD=0.53%，藿香正氣滴丸中總多糖RSD=0.35%，表明糖量計法重復(fù)性均良好。

2.8 ?穩(wěn)定性試驗

2.8.1 ?色譜法

取“2.3.1”項下藿香正氣水和藿香正氣滴丸HPLC供試品溶液，分別在0、4、8、16、24、48 h進樣分析，進樣量20 μL，結(jié)果和厚樸酚峰面積RSD分別為1.19%、1.68%，表明HPLC供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.8.2 ?糖量計法

取“2.3.2”項下藿香正氣水和藿香正氣滴丸糖量計法供試品溶液，分別在0、4、8、16、24、48 h點樣分析，結(jié)果總多糖RSD分別為1.55%、1.15%，表明糖量計法供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.9 ?加樣回收率試驗

2.9.1 ?色譜法

取“2.3.1”項下藿香正氣水和藿香正氣滴丸HPLC供試品溶液0.5 mL，分別加入“2.2.1”項下和厚樸酚對照品溶液0.5 mL，搖勻，即得加樣回收供試品溶液，各平行配制6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，分別計算回收率。結(jié)果藿香正氣水和藿香正氣滴丸中和厚樸酚平均回收率分別為100.07%、100.00%，RSD分別為1.04%、0.87%，見表1。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.9.2 ?糖量計法

取“2.3.2”項下藿香正氣水和藿香正氣滴丸總多糖糖量計法供試品溶液0.5 mL，分別加入“2.2.2”項下蔗糖溶液0.5 mL，搖勻，即得加樣回收供試品溶液，各平行配制6份，按“2.1.2”項下糖量計法條件測定，分別計算回收率。藿香正氣水和藿香正氣滴丸中總多糖平均回收率分別為98.50%、98.02%，RSD分別為1.79%、0.48%，見表2。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.10 ?樣品含量測定

2.10.1 ?色譜法

按“2.3.1”項下方法制備藿香正氣水和藿香正氣滴丸HPLC供試品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。采用回歸方程法和外標(biāo)法，以藿香正氣滴丸與藿香正氣水每劑等量計算和厚樸酚含量，結(jié)果見表3。2種方法計算所得差異較小，均適用于和厚樸酚含量計算，本研究以2種方法計算結(jié)果的平均值作為和厚樸酚含量值。

2.10.2 ?糖量計法

按“2.3.2”項下方法制備藿香正氣水和藿香正氣滴丸糖量計法供試品溶液，并按“2.1.2”項下糖量計法條件進行測定，用回歸方程法計算，以藿香正氣滴丸與藿香正氣水每劑等量計，結(jié)果見表4。2種制劑的總多糖含量RSD=78.08%，濃度RSD=79.91%。

2.11 ?聚類分析

指標(biāo)及變量越多，對數(shù)據(jù)整體分析的難度就越大，因此，通常在處理多變量、多指標(biāo)數(shù)據(jù)時，需要對指標(biāo)進行篩選。本研究考察了不同指標(biāo)（和厚樸酚峰面積、百分峰面積及總多糖百分含量）對6次重復(fù)性的藿香正氣水和藿香正氣滴丸分類的影響，聚類分析結(jié)果見圖2～圖5。

可見，和厚樸酚峰面積、百分峰面積及總多糖百分值三者同時作為參數(shù)時可對藿香正氣水和藿香正氣滴丸進行準(zhǔn)確分類，和厚樸酚峰面積和總多糖百分值可分別對藿香正氣水和藿香正氣滴丸進行準(zhǔn)確分類，而百分峰面積將藿香正氣水和藿香正氣滴丸亂序分類。因此，以和厚樸酚峰面積及總多糖百分值作為藿香正氣水和藿香正氣滴丸分類指標(biāo)，較百分峰面積更能體現(xiàn)不同制劑間的差異，既不會丟失有用的指標(biāo)信息，又能減少某類指標(biāo)帶來的誤差，降低整體分析的難度。

3 ?討論

本試驗采用HPLC在15 min內(nèi)快速、同時測定藿香正氣制劑中和厚樸酚含量，以糖量計法快速測定其總多糖含量，并對多類指標(biāo)比較分析其差異性，分別進行了方法學(xué)研究。HPLC通過和厚樸酚回歸方程法和外標(biāo)法計算得出藿香正氣水和藿香正氣滴丸的和厚樸酚含量，采用糖量計法測定了藿香正氣水和藿香正氣滴丸中總多糖含量，以小分子化合物及總糖含量同時作為評價指標(biāo)用于質(zhì)量控制和不同劑型間的差異考察，具有系統(tǒng)性、特征性、穩(wěn)定性的特點，能實現(xiàn)快速、直觀、有效的質(zhì)量控制，達到多類指標(biāo)控制不同劑型藿香正氣制劑的質(zhì)量，并為不同劑型間“蕩”與“緩”的療效差異提供依據(jù)。

本研究通過對比考察不同指標(biāo)（和厚樸酚峰面積、百分峰面積及總多糖百分值）的聚類分析結(jié)果，篩選出和厚樸酚峰面積和總多糖百分值作為藿香正氣水和藿香正氣滴丸的指標(biāo)來體現(xiàn)不同制劑間的差異，降低了數(shù)據(jù)整體分析的難度。

本試驗通過對2種藿香正氣制劑中和厚樸酚含量及總多糖含量進行比較，分析得到藿香正氣水的和厚樸酚濃度為（0.400 8±0.005 0）mg/mL，總多糖含量為（17.0±0.15）%，相當(dāng)于（0.31±0.003）g/mL;等劑量藿香正氣滴丸中的和厚樸酚濃度為（0.487 9±0.008 9）mg/mL，總多糖含量為（59.0±0.28）%，相當(dāng)于（1.120±0.005）g/mL。2種藿香正氣制劑的和厚樸酚含量及總多糖含量均有明顯差異，等劑量藿香正氣滴丸中和厚樸酚含量較藿香正氣水略高，而總多糖含量明顯高于藿香正氣水。通過小分子化合物和總多糖含量分析，能達到多類指標(biāo)同時控制不同劑型藿香正氣制劑的質(zhì)量，也可以為同藥不同劑型間的療效差異提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-09-17）

（修回日期：2018-10-09;編輯：陳靜）