全波長掃描式多功能讀數(shù)儀-硫酸肼還原比色法測定水中硝態(tài)氮含量

郭文淼，何烈湯，，張金堯，辛 宇，汪 洪*

［1.遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/國家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（北京）/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全肥料源性因子風(fēng)險評估實驗室（北京），北京 100081］

水中硝態(tài)氮的含量過高時，會對人體健康產(chǎn)生一定影響。進入人體的硝態(tài)氮可被還原成亞硝態(tài)氮，與血液中血紅蛋白作用生成高鐵血紅蛋白，從而導(dǎo)致血液失去攜氧能力，另外，還可與體內(nèi)的二級胺類形成具有致癌、致突變危害的亞硝胺。硝態(tài)氮的含量高低是體現(xiàn)水體環(huán)境質(zhì)量重要參數(shù)之一，目前我國對居民生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）硝態(tài)氮限值為10 mg/L，地下水源限制不得超過20 mg/L［1］。硝態(tài)氮的測定方法很多，主要包括麝香草酚分光光度法、紫外分光光度法、離子色譜法、鎘柱還原法、戴氏合金還原法等［2-7］。麝香草酚分光光度法操作較繁瑣，試劑配制過程復(fù)雜，所用化學(xué)試劑酸和氨水等對環(huán)境有影響。紫外分光光度法多用于硝酸鹽含量高，有機物含量低的水樣測定，但易受水中有機物的干擾。離子色譜法靈敏度高、穩(wěn)定性好，但設(shè)備較昂貴。通過硫酸肼作為還原劑，將硝態(tài)氮還原為亞硝態(tài)氮，再利用對氨基苯磺酰胺及N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，簡稱NEDD）反應(yīng)生成粉紅色化合物，于540 nm處測得吸光度，可用于水中硝態(tài)氮含量的測定［8］。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 7480-87《水質(zhì)硝酸鹽氮的測定酚二磺酸分光光度法》是目前水體中硝態(tài)氮的常用分析測定方法，該方法測量范圍較大，顯色穩(wěn)定，是水質(zhì)監(jiān)測的推薦方法。但是該方法對反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，較難控制，易受水中含氯化物、亞硝態(tài)氮、銨鹽、有機物和碳酸鹽的干擾，造成測定結(jié)果準(zhǔn)確度低。張英利等［9］利用連續(xù)流動分析儀結(jié)合硫酸肼還原比色法測定土壤硝態(tài)氮。

全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（酶標(biāo)儀）采用多孔排列微孔板作為樣品容器，由計算機控制設(shè)置特定波長，可快速讀取微孔板內(nèi)樣品顯色后吸光度，適用于大批量樣品分析，操作簡便。若采用96孔微孔板，每個孔板總體積為300 μL，試劑消耗明顯減少。Ringuet等［10］采用了酶標(biāo)儀測量水中硝態(tài)氮含量，其原理是采用混合酶作為還原劑，將水中硝態(tài)氮還原成亞硝態(tài)氮，再與磺胺發(fā)生重氮反應(yīng)后與NEDD反應(yīng)生成粉紅色化合物于540 nm處測得吸光度。郭文淼等［11］建立了酶標(biāo)儀-靛酚藍測定水中銨態(tài)氮的方法，方法檢出限為0.046 mg/L，測定重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。本研究目的擬探討利用酶標(biāo)儀結(jié)合硫酸肼還原比色法測定水體中硝態(tài)氮，并與連續(xù)流動儀測定結(jié)果比較，旨在建立一個快速、準(zhǔn)確、靈敏的測定水體硝態(tài)氮的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（酶標(biāo)儀）（型號：Varioskan Flash，Thermo Scientific公司）、連續(xù)流動分析儀（型號：AutoAnalyzer 3，SEAL Analytical，ltd.公司）。

1.2 試劑

硫酸銅溶液：用稱量紙稱取0.1 g五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）于100 mL燒杯，加入約50 mL去離子水，溶解后移至100 mL容量瓶中定容。

硫酸鋅溶液：用稱量紙稱取1 g硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）于100 mL燒杯，加入約50 mL去離子水，溶解后移至100 mL容量瓶中定容。

氫氧化鈉溶液：稱量瓶稱取1 g氫氧化鈉（NaOH）溶入盛有約50 mL去離子水的塑料燒杯中，溶解后移至100 mL塑料容量瓶中定容。

硫酸肼溶液：用稱量紙稱取0.2 g硫酸肼加入約60 mL去離子水待完全溶解，再加入1 mL硫酸銅溶液，1 mL硫酸鋅溶液定容至100 mL。

顯色劑：先在50 mL去離子水中加入10 mL磷酸，加入1 g對氨基苯磺酰胺、0.05 g NEDD，溶解，定容至100 mL，儲存于棕色瓶中。

硝態(tài)氮（NO3--N）標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取7.218 g經(jīng)105～110 ℃干燥2 h的優(yōu)級純硝酸鉀，溶于去離子水，移至1 000 mL容量瓶中，加入2 mL三氯甲烷作保存劑，混勻，定容。硝態(tài)氮（NO3--N）標(biāo)準(zhǔn)使用液：取5.00 mL硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中定容。

實驗所用試劑除標(biāo)明外皆為分析純。實驗用水為三級去離子水。

1.3 實驗步驟

選擇96孔微孔板，利用移液器在每個孔板中加入60 μL待測水樣，加入氫氧化鈉溶液60 μL，加入還原劑硫酸肼溶液60 μL，蓋住，在室溫下放置30 min，然后加入顯色劑，放置1 min，于400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，測定吸光度，確定最大吸收波長為545 nm。

6個水樣顯色0.5、1、2、3、4 h，在最大吸收波長（545 nm）處分別測定吸光度，發(fā)現(xiàn)在顯色后2 h內(nèi)反應(yīng)體系吸光度無顯著性變化，超過2 h吸光度有所下降，因此確定本測定體系的顯色穩(wěn)定時間為2 h。

用硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制質(zhì)量濃度ρ（NO3--N）為0、0.5、1、3、5、7、10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照上述條件測定，將吸光度與NO3--N標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度ρ（NO3--N）之間進行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸直線方程y=0.292 4x-0.065 3，相關(guān)系數(shù)R為0.997 1。

圖1 酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

1.4 連續(xù)流動分析儀測定步驟

連續(xù)流動分析儀測定水樣中硝態(tài)氮原理是在堿性條件下，水樣中NO3--N被硫酸肼還原成NO2

--N，然后與對氨基苯磺酰胺生成重氮鹽，再與及N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（NEDD）偶聯(lián)生成粉紅色的化合物，測定吸光值。流動分析儀設(shè)置進樣速率60樣/h，進樣與清洗比為3.0∶1，進樣時間45 s，清洗時間15 s。儀器默認(rèn)設(shè)置基線和漂移校正，自動基線參比為4%；比色濾光片波長為550 nm，燈強度大于l 000 mV。

1.5 統(tǒng)計分析

每個水樣品重復(fù)測定6次，6次測量值Xi的算術(shù)平均值為樣品硝態(tài)氮含量的估計值，即測量結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)偏差用貝塞爾公式計算，即：

其中n=6，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

采用Excel軟件中分析工具庫t-檢驗，進行成對雙樣本均值分析連續(xù)流動分析儀測定結(jié)果和酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法測定數(shù)據(jù)間差異顯著性；兩種方法測定數(shù)據(jù)之間進行相關(guān)分析，利用直線方程進行回歸，統(tǒng)計分析相關(guān)系數(shù)的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法檢出限

圖2 酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法測定試劑空白硝態(tài)氮（-N）質(zhì)量濃度

2.2 酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法測定精密度

在相同測量條件下，利用酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法對4個水樣中硝態(tài)氮含量分別進行了6次重復(fù)測量，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，在1.5%～4.4%范圍內(nèi)（表1），測定結(jié)果重復(fù)性較好。

表1 水樣硝態(tài)氮（-N）質(zhì)量濃度測定結(jié)果的重復(fù)性

表1 水樣硝態(tài)氮（-N）質(zhì)量濃度測定結(jié)果的重復(fù)性

水樣編號相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）1 7.78 7.62 8.09 8.05 7.85 7.97 7.89 2.2 2 2.63 2.53 2.66 2.69 2.49 2.66 2.61 3.1 3 0.71 0.65 0.68 0.67 0.72 0.65 0.68 4.4 4 4.47 4.60 4.50 4.48 4.39 4.48 4.49 1.5質(zhì)量濃度ρ（NO3--N mg/L）平均值（mg/L）

2.3 酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法測定準(zhǔn)確度—加標(biāo)回收率

選擇3個水樣，根據(jù)每個樣品的濃度分別加入高、中、低不同濃度-N標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照同樣實驗步驟操作，進行加標(biāo)回收實驗，測定結(jié)果見表2。從表2中可見，樣品加標(biāo)回收率在88.0%～109.8%之間。

表2 樣品中-N加標(biāo)回收實驗測定結(jié)果

表2 樣品中-N加標(biāo)回收實驗測定結(jié)果

樣品 原樣質(zhì)量濃度 添加質(zhì)量濃度 測定質(zhì)量濃度 回收率（%）ρ（NO3--N mg/L）水樣1 7.72 3.00 5.18 88.0 7.00 7.71 109.8 10.00 9.08 104.3水樣2 4.51 3.00 3.79 102.1 5.00 4.92 106.5 7.00 6.23 97.2水樣3 1.99 1.00 1.45 90.7 3.00 2.45 101.0 5.00 3.52 97.4

2.4 與連續(xù)流動分析儀測定結(jié)果比較

圖3列出了酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法和連續(xù)流動分析儀對29個水樣中硝態(tài)氮（NO3--N）的測定結(jié)果，兩種方法測定硝態(tài)氮質(zhì)量濃度范圍分別為0.90～9.30和0.94～4 10.33 mg/L，平均值分別為3.44和3.21 mg/L，t檢驗的雙尾P值小于0.05（表3），兩種方法測定結(jié)果彼此間無顯著性差異。

圖3 連續(xù)流動分析儀和酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法測定水樣中硝態(tài)氮（-N）結(jié)果比較

表3 t檢驗-成對雙樣本均值比較分析酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法和連續(xù)流動分析儀測定結(jié)果

圖4 連續(xù)流動分析儀與酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法測定水樣中硝態(tài)氮（-N）結(jié)果相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本文采用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（酶標(biāo)儀）結(jié)合硫酸肼還原比色法測定水中硝態(tài)氮（NO3--N）的含量，檢出限為0.015 mg/L；方法的加標(biāo)回收率在88.0%～109.8%之間；與連續(xù)流動分析儀法相比，兩者測定數(shù)據(jù)之間呈良好的線性相關(guān)關(guān)系，回歸直線方程為Y（連續(xù)流動分析儀）=1.153X（酶標(biāo)儀-硫酸肼還原比色法）-0.255，相關(guān)系數(shù)R=0.987**（n=29，P＜0.01）；方法精密度較高，重復(fù)測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（酶標(biāo)儀）結(jié)合硫酸肼還原比色法測定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，可用于水樣中硝態(tài)氮（NO3--N）含量的批量測定。