一株木質(zhì)素降解菌的篩選鑒定及其在堆肥中的應用

尹 靜，劉悅秋，于 峰，蔡建超，劉天月

（北京農(nóng)學院園林學院，北京 102206）

木質(zhì)纖維素是地球上分布最廣，含量最豐富的可再生高能聚合物，每年再生的木質(zhì)纖維素折合成能量相當于人類年消耗能量的20倍［1］。木質(zhì)素主要存在于木材和秸稈中，是農(nóng)林產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，每年全世界產(chǎn)量約1 500億t，是儲量巨大的潛在綠色資源［2］。然而，目前全世界對農(nóng)林廢棄物的利用率卻很低，每年因農(nóng)林廢物焚燒、填埋等造成巨大的環(huán)境污染和資源浪費［3］。木質(zhì)素是一類由5-羥基松柏醇、對香豆醇、芥子醇和松柏醇形成的酚類聚合物［4］，主要包圍于管胞、導管和木纖維等纖維束細胞及厚壁細胞外［5］，由于它沒有明確的結(jié)構(gòu)，很難直接對其進行轉(zhuǎn)化和利用，但可以通過降解將其轉(zhuǎn)化為酚類化合物等低分子量的化合物，為資源轉(zhuǎn)化和利用提供更多的可能［6］。木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)比較復雜，在自然條件下降解速度緩慢，傳統(tǒng)的物理、化學方法成本高，木質(zhì)素的去除率低，還污染環(huán)境［7］，而生物降解法因?qū)Ｒ恍詮?、降解率高、環(huán)保，且成本較低等優(yōu)點而被廣泛應用［8］，成為農(nóng)林廢棄物開發(fā)利用研究的熱點。

自然界中真菌是降解木質(zhì)素的主要微生物，另外還包括一些細菌和病毒［9］。從自然界中篩選發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素降解微生物，成為近年來許多學者關(guān)注的重點。馮波等［10］從腐爛的木材中篩選到一株能夠高效降解木質(zhì)素的菌株，經(jīng)ITS測序分析和形態(tài)觀察，確定該菌為毛栓菌（Trametes hirsuta）。錢靜亞等［11］通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉能夠產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶，且木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）活性分別可達2.08、1.79 U/g。馬英輝等［12］從造紙廠污泥中分離得到一株木質(zhì)素降解放線菌灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens），該菌對木質(zhì)素的降解率可達60%以上，其對木質(zhì)素的降解主要依靠胞外漆酶（Lac）和胞外Lip。張鵬飛等［13］從園林廢棄物高溫期堆肥中，分離篩選出一株木質(zhì)素降解力較強的細菌嗜熱嗜脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus），Lac、Lip活力分別高達12.26、42.41 U/mL，且對木質(zhì)素的降解率達到了20.1%。陳瑩等［14］從園林廢棄物高溫好氧發(fā)酵堆體中篩選出一株降解木質(zhì)素的鏈霉菌（Streptomyces sp.），將該菌接種到小葉榕的碎枝條上，測定結(jié)果表明，接種了該菌的枝條中木質(zhì)素的質(zhì)量分數(shù)降低了22.48%。本研究從森林土壤中篩選、分離、鑒定高木質(zhì)素分解活性微生物，并將其應用于農(nóng)林廢棄物堆肥，探究其對堆肥效果的影響，以期發(fā)現(xiàn)新的對縮短堆肥發(fā)酵周期，提高發(fā)酵質(zhì)量有顯著作用的堆肥菌劑，為解決城市環(huán)境污染和自然資源浪費問題提供一種有效的解決辦法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分離菌種的土壤樣品采自鷲峰林下腐殖土。堆肥所需的枯枝落葉來源于北京農(nóng)學院校園綠化廢物，豬糞購自周邊農(nóng)村。

1.2 木質(zhì)素降解菌株的篩選

將土壤樣品按10-3～10-6的濃度梯度充分溶解于無菌水中，吸取混合液接種于PDA培養(yǎng)基上，并于28℃下培養(yǎng)5～7 d；根據(jù)菌落形態(tài)初步判定真菌、細菌和放線菌，然后接種于相應的培養(yǎng)基上，反復接種純化直至獲得純菌株。將純化后的菌株接種于PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)5 d，觀察是否產(chǎn)生紅棕色變色圈及變色圈的大小，篩選產(chǎn)漆酶（Lac）的菌株［15］；同樣的，將純化后的菌株接種于PDA-苯胺藍培養(yǎng)基平板，28℃避光培養(yǎng)10 d，觀察是否產(chǎn)生褪色圈及褪色圈的大小，篩選產(chǎn)錳過氧化物酶（MnP）和木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的菌株［16］。

1.3 產(chǎn)木質(zhì)素降解酶及酶活實驗

用打孔器在菌落的邊緣打直徑5 mm孔，滴入數(shù)滴用96%乙醇配制的0.1 mol/L的α-萘酚（紫色顯色圈-Lac），等量現(xiàn)配的4% H2O2與1%焦酚混合液（黃褐色顯色圈-LiP、MnP），根據(jù)顯色情況觀察菌株是否產(chǎn)酶。將液體培養(yǎng)基置于35℃，150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h后，取0.2 mL接種于100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)48 h。每隔24 h取樣測酶活，將培養(yǎng)好的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基先用紗布過濾，再將濾液于4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清液即為粗制酶液。通過藜蘆醇法，Mn2+法和ABTS法分別進行木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶活性的測定［17］。

1.4 木質(zhì)素降解能力的測定

將玉米秸稈粉碎過0.425 mm篩，分裝于25個250 mL三角瓶，每瓶20 g，加入60 mL營養(yǎng)液［18］，高溫滅菌3 h，接入YZC3菌種，質(zhì)量分數(shù)為10%。然后適溫培養(yǎng)（28℃），培養(yǎng)箱內(nèi)相對濕度保持在80%，共培養(yǎng)25 d，5 d后開始取樣，以后每5 d取一次樣，每個處理取5瓶。每瓶取2 g待測樣品置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 2 mol/L HCl，100℃保溫50 min后用3號砂芯漏斗過濾，水洗殘渣至pH值為6.5～7.0。將上一步得到的濾渣80℃烘干，連同砂芯漏斗置于150 mL燒杯中，加入10 mL 72%的H2SO4，降解4 h，加入90 mL蒸餾水，室溫過夜，次日用蒸餾水水洗殘渣至pH 6.5，烘干至恒重為W2，W2在550℃的馬弗爐中灰化，得灰分W，木質(zhì)素含量=W2-W1［19］。

木質(zhì)素降解率=（原始玉米秸稈木質(zhì)素含量-固態(tài)發(fā)酵后玉米秸稈木質(zhì)素含量）/原始玉米秸稈木質(zhì)素含量×100%。

1.5 菌株的鑒定

參照《真菌鑒定手冊》對篩選所得的木質(zhì)素降解菌YZC3進行形態(tài)特征觀察和初步鑒定。分子生物學鑒定采用ITS rDNA測序分析。PCR擴增和序列測定：提取菌株總DNA為模板，采用真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）， 擴 增 其ITS序列。PCR擴增體系參照文獻［20］。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對（BLAST），然后用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.6 堆肥實驗

將收集的枯枝落葉與豬糞按1∶1混合，加入YZC3攪拌均勻，接種質(zhì)量分數(shù)為1%，將不加菌的堆肥作為空白對照處理，每個處理進行3次重復。堆肥期間每天進行溫度測定；堆肥結(jié)束時取樣，將樣品陰干粉碎后進行pH值、碳氮比（C/N）、種子發(fā)芽指數(shù)（GI）、電導率、全氮（TN）、全磷（TP）、全鉀（TK）和腐植酸含量等指標的測定。測定方法根據(jù)中華人民共和國有機肥料農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY525-2012。發(fā)芽指數(shù)（GI）選用白菜種子30℃下培養(yǎng)48 h測發(fā)芽率和根長，每個處理重復3次，GI=（浸提液中的種子發(fā)芽率×種子根長）/（蒸餾水中的種子發(fā)芽率×種子根長）×100%。

表1 堆肥材料理化性質(zhì)

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素降解菌的篩選

從鷲峰林下的腐殖土樣品中分離出15種菌株，將15種菌株純化后接種于PDA-愈創(chuàng)木酚和PDA-苯胺藍培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有YZC3既能使PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色（圖1）也能使PDA-苯胺藍平板脫色（圖2）。

圖1 YZC3愈創(chuàng)木酚顯色反應

圖2 YZC3苯胺藍脫色反應

2.2 產(chǎn)酶及酶活測定

LiP、MnP產(chǎn)酶實驗結(jié)果如圖3所示，向平板內(nèi)打孔處滴加等量4%與1%焦酚混合液后，出現(xiàn)黃褐色顯色圈，說明YZC3能產(chǎn)生LiP和MnP。Lac產(chǎn)酶實驗結(jié)果如圖4所示，向平板內(nèi)打孔處滴加0.1 mol/L用96%乙醇配制的α-萘酚溶液后，出現(xiàn)紫色顯色圈，說明YZC3能產(chǎn)生Lac。

圖3 YZC3產(chǎn)LiP、MnP酶實驗

圖4 YZC3產(chǎn)Lac酶實驗

對YZC3進行木質(zhì)素分解酶活力測定，如圖5所示，在第8 d，YZC3產(chǎn)Lac出現(xiàn)酶活力峰值，為5.556 U/mL；YZC3產(chǎn)LiP和MnP能力較強，LiP在第7 d出現(xiàn)峰值，其酶活力為12.903 U/mL；MnP在10～12 d出現(xiàn)酶活力高峰，峰值為16.4 U/mL，顯示出YZC3具有較強的木質(zhì)素降解能力。

圖5 酶活力隨時間變化

由圖6的數(shù)據(jù)可知，YZC3對木質(zhì)素的降解率隨著固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長而增加，25 d時對木質(zhì)素的降解率達到了最大值（79.2%）。司夢瑩等［21］從某制漿造紙廠的廢水污泥中篩選出2株高效木質(zhì)素降解菌，分別為鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium）LD-1和芽孢桿菌屬（Bacillus）的菌株LD-2，其木質(zhì)素降解能力最高分別達到52.23%和50.36%。錢靜亞等［11］用3種木質(zhì)素降解菌發(fā)酵玉米芯粉，發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌木質(zhì)素降解率最高，為11.7%。對比可見，YZC3是一種高效木質(zhì)素降解菌。

圖6 YZC3木質(zhì)素降解率隨時間變化

2.3 菌種鑒定結(jié)果

2.3.1 YZC3的形態(tài)特征

由圖7和圖8可知，YZC3在PDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落直徑40～43 mm，絮狀，白色，中部略帶淺黃色；背面淺黃色，色素不滲入培養(yǎng)基。菌絲直徑約為8～12 μm；分生孢子梗高大，長200 μm，寬3.0～5.0 μm，帚狀或輪狀分枝，產(chǎn)孢細胞呈燒瓶形（帚狀分枝）或披針形（輪狀分枝），（9.0～38.5）×（1.5～2.5）μm，頂端寬不足1 μm；分生孢子橢圓形、腎形，無色，壁光滑，（3.3～6.7）×（2.0～3.2）μm，聚集成團。

圖7 YZC3菌落形態(tài)

圖8 YZC3掃描電鏡圖

2.3.2 YZC3的ITS序列片段分析

將PCR擴增獲得的ITS序列在NCBI上進行BLAST，使用軟件MEGA 7.0將YZC3與11株菌進行Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。如圖9所示，YZC3與登錄號為HQ607798的粉紅粘帚霉同源性最高，親緣關(guān)系最近。通過形態(tài)學特征及分子生物學鑒定，確定YZC3為粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）。

圖9 基于ITS序列構(gòu)建的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 YZC3對枯枝落葉堆肥的影響

2.4.1 YZC3對堆肥腐熟的影響

腐熟度是堆肥中的有機物經(jīng)過礦化、腐殖化后達到穩(wěn)定化的程度，是衡量堆肥產(chǎn)品質(zhì)量好壞的一個綜合指標，可以根據(jù)堆肥的溫度、C/N、電導率、pH值和GI來判斷。我國《糞便無害化衛(wèi)生標準》（GB7959-87）規(guī)定，堆肥溫度在50℃以上并持續(xù)5～7 d，便符合糞便無害化標準。如圖10所示，加菌堆肥初期溫度快速升至最高，持續(xù)11 d后下降至50℃以下，經(jīng)過較長的后熟期后，溫度回歸到環(huán)境溫度，比CK處理高溫持續(xù)天數(shù)多6 d；YZC3處理二次發(fā)酵天數(shù)也比CK多3 d（表2），說明YZC3有利于延長堆肥高溫期，提高堆體溫度，有效殺死堆肥中的病原微生物。劉月等［22］研究表明高溫期和二次發(fā)酵期是木質(zhì)素快速降解的時期，較長的高溫期有利于木質(zhì)素的充分降解，也說明YZC3有利于堆肥中木質(zhì)素的降解。C/N是判斷堆料腐熟程度的重要指標，堆肥過程中C/N不斷下降，理論上應趨于微生物菌體的C/N即16左右［23］，但對一些原料來講，其本身的C/N過高或過低，所以C/N降到16左右難以作為廣義的指標參數(shù)使用。Morel等［24］建議采用T=（終點C/N）/（初始C/N）來評價腐熟度，認為當T值小于0.6時堆肥達到腐熟。如表2所示，YZC3處理T值顯著低于對照且低于0.6，說明其有助于堆肥的腐熟。電導率和GI也是判斷堆肥腐熟程度的指標。電導率是以數(shù)字表示的溶液傳導電流的能力，離子濃度越高，導電能力越強；離子濃度高則表明堆肥中有機質(zhì)分解的多，堆肥腐熟程度越高。如表2所示，YZC3處理的電導率顯著高于空白處理，同樣說明YZC3有利于堆肥材料分解和堆肥腐熟。未腐熟堆肥含有高濃度的低分子量有機酸、多酚等植物生長抑制物質(zhì)，這些物質(zhì)隨著堆肥進程逐漸被降解轉(zhuǎn)化［25］。GI不僅可以體現(xiàn)堆肥的植物毒性，還能夠判斷堆肥的腐熟程度，通常認為，當GI大于80%，堆肥已無植物毒性或者說堆肥已腐熟［26］。由表2可知，各處理的發(fā)芽指數(shù)雖無顯著差異，但YZC3處理GI大于80%，而CK處理接近80%，也說明YZC3有助于加速堆肥腐熟。

圖10 堆肥溫度變化曲線

表2 堆肥腐熟程度指標

2.4.2 YZC3對堆肥品質(zhì)的影響

堆肥中TN、TP、TK以及腐殖質(zhì)的含量是評價肥料的重要指標，全效養(yǎng)分含量越高，堆肥品質(zhì)越好。如表3所示，加入YZC3的堆肥中TN含量顯著高于空白對照，說明該菌有助于減少堆肥過程中氮素的損失；而各處理中TP、TK的含量并無顯著差異，說明YZC3對TP、TK含量的影響不大。

表3 堆肥養(yǎng)分指標 （mg/g）

在堆肥過程中，原料中的有機質(zhì)在降解的同時還進行著腐殖化過程。腐殖質(zhì)含有大量的官能團（如羧基、酚羥基等），能夠吸附和固定重金屬離子，而腐殖質(zhì)在土壤中通常以游離的腐植酸和腐植酸鹽類狀態(tài)存在。Lopez等［27］評價了真菌作用下木質(zhì)素生物降解與腐殖質(zhì)產(chǎn)生的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明真菌顯著降解木質(zhì)素，加強了聚合產(chǎn)物的生成，促進土壤腐殖質(zhì)產(chǎn)生。郁紅艷［28］的研究也表明，接種木質(zhì)素降解菌能促進發(fā)酵體系中腐殖質(zhì)的形成，不僅表現(xiàn)在使發(fā)酵體系中腐殖質(zhì)含量更高，且能夠明顯縮短腐殖質(zhì)形成時間。本實驗如表3所示，YZC3處理的堆肥中腐植酸含量顯著高于空白對照，說明YZC3能夠加速木質(zhì)素降解，形成腐植酸，有助于堆肥的腐殖化過程，與上述研究結(jié)果一致。

3 討論

微生物有3類酶系與木質(zhì)素的降解有關(guān)，H2O2產(chǎn)生酶系（乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶等）、木質(zhì)素氧化酶系（木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶等）、其他酶系（纖維二糖脫氫酶、甲基化酶等）［29］。研究最多并被公認為最重要的3類木質(zhì)素降解酶是木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac），這3種酶在木質(zhì)素降解過程中的作用主要是攻擊木質(zhì)素聚合物結(jié)構(gòu)，將其解聚成更小的分子或者單體的苯環(huán)物質(zhì)［30］，是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶。MnP能通過降解反應氧化木質(zhì)素中約占10%的抗性更強的酚結(jié)構(gòu)，它以H2O2為氧化劑，氧化Mn2+生成Mn3+，Mn3+能夠穿透木材，氧化酚型有機物［31］。LiP是一系列含F(xiàn)e3+、卟啉環(huán)和血紅素輔基的同工酶，可以利用H2O2及有機過氧化物催化一系列底物，其催化具有非特異性［32］。Lac是一種含有4個銅離子的多酚氧化酶［33］，它的氧化底物極為廣泛，包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等［34］。本項研究篩選到的粉紅粘帚霉YZC3菌株具有高效的木質(zhì)素降解能力，木質(zhì)素的降解率達到了79.2%，可以同時產(chǎn)LiP、MnP和Lac 3種重要的木質(zhì)素酶，且MnP酶活性較高，為16.4 U/mL，這也表明粉紅粘帚霉YZC3菌株不僅可以降解固體廢物中的木質(zhì)纖維素，同時它還可以處理芳香有機物等污染物，特別是苯酚類物質(zhì)。苯酚廣泛應用于石油煉制、石油化工、制藥和樹脂制造等行業(yè)，因此也是這些行業(yè)廢水中的主要污染物［35］，粉紅粘帚霉YZC3菌株因其具有較高的MnP酶活性，在處理苯酚污染方面具有潛力。

粉紅粘帚霉除了能夠降解園林廢棄物，還是一種生物防治劑，可以抑制多種植物病原菌的孢子形成并殺死病原線蟲［36-37］和蚜蟲［38］，它不僅對病原菌具有重寄生、競爭、抗性和溶菌等作用，還能誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性［39］。李丹陽等［40］研究發(fā)現(xiàn)，粉紅粘帚霉可從源頭上遏制稻曲病的發(fā)生；王淑芳等［41］研究發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉對水稻紋枯病的防治效果十分顯著；王瑞虎［42］研究發(fā)現(xiàn)，粉紅粘帚霉能在番茄果實接種灰葡萄孢菌后誘導植物產(chǎn)生非寄主抗性；李叔強等［43］發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉對黃瓜枯萎病具有一定的防治作用；高航［44］研究發(fā)現(xiàn)紅粘帚霉對楊樹潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea），腐爛病菌（Valsa mali），楊樹腐爛病菌（Valsa sordida），尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制率均達到60%以上；Sun等［45］通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，粉紅粘帚霉具有16個與厚垣孢子形成相關(guān)的基因，對其生物防治的分子機制有了初步的探索和了解。綜上所述，YZC3具有極高的開發(fā)利用價值，它不僅能夠防治多種植物病原菌，殺死病原線蟲和蚜蟲，還可以降解園林廢棄物，在解決園林廢棄物污染問題的同時，可生產(chǎn)生物質(zhì)抗病蟲菌肥，是一種寶貴的微生物資源。

4 結(jié)論

本研究篩選到1株高效木質(zhì)素降解菌YZC3，對木質(zhì)素的降解率達到79.2%。通過ITS rDNA基因測序，并結(jié)合形態(tài)特征觀察，確定YZC3為粉紅粘帚霉。產(chǎn)酶及酶活實驗表明，YZC3產(chǎn)MnP的能力較強，產(chǎn)LiP、Lac能力次之。

粉紅粘帚霉YZC3作為堆肥菌劑延長了堆肥過程中的高溫期及二次發(fā)酵時間，可顯著促進堆肥腐熟，有利于提高堆肥中腐植酸的含量，減少堆肥中TN的損失，提高了堆肥品質(zhì)，是一種極具應用價值的堆肥菌劑。