HPLC同時(shí)測(cè)定何首烏中5種成分及指紋圖譜的建立

王玨 朱育鳳 姚毅 金超 邱明鳴 劉史佳

摘要：目的 ?建立HPLC同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地何首烏中5種指標(biāo)性成分含量的方法，并建立何首烏HPLC指紋圖譜分析方法。方法? 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，測(cè)定何首烏樣品中五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚含量，用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，建立何首烏HPLC指紋圖譜并進(jìn)行分析。結(jié)果? 何首烏中5種指標(biāo)性成分的進(jìn)樣量在線性范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4。安徽阜陽(yáng)樣品中五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素甲醚含量最高（分別為0.048 9%、0.036 1%、3.179 9%、0.551 2%），貴州安順樣品中大黃素含量最高（0.423 8%）;安徽阜陽(yáng)樣品中指標(biāo)成分平均總含量最高（3.966 6%），其次為安徽亳州（2.769 8%）、貴州（2.469 4%）及四川（2.306 3%）。云南何首烏樣品與其他產(chǎn)地的指紋圖譜差異較大，且二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚成分未檢出。14批樣品指紋圖譜有18個(gè)共有峰，指認(rèn)了2、4、7、17、18號(hào)峰分別為五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚。結(jié)論? 本試驗(yàn)建立的方法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，能有效用于何首烏的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：何首烏;含量測(cè)定;指紋圖譜;聚類分析

中圖分類號(hào)：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）06-0075-07

Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the contents of five kinds of index components in Polygoni Multiflori Radix from different producing areas; To establish HPLC fingerprint analysis method of Polygoni Multiflori Radix. Methods Agilent Eclipse XDB-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used， with acetonitrile - 0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase， gradient elution， to determine the contents of galloyl glucose， gallic acid， stilbene glycoside， emodin， and emodin methyl ether in Polygoni Multiflori Radix， and SPSS19.0 software was used to conduct clustering analysis for the data. HPLC fingerprints of Polygoni Multiflori Radix were established and analyzed. Results The injection volume of five index components of Polygoni Multiflori Radix showed a good linear relationship with the peak area integral value in the linear range， and the correlation coefficient were all higher than 0.999 4. The results of the content determination showed that the contents of galloyl glucose， gallic acid， stilbene glycoside， and emodin methyl ether in Polygoni Multiflori Radix from Fuyang， Anhui Province was the highest （0.048 9%， 0.036 1%， 3.179 9%， 0.551 2%， respectively）， and the content of emodin of Polygoni Multiflori Radix from Anshun， Guizhou Province was the highest （0.423 8%）. The average total content of index components of sample from Fuyang， Anhui Province was the highest （3.966 6%）， followed by samples from Bozhou， Anhui Province （2.769 8%）， Guizhou Province （2.469 4%） and Sichuan Province （2.306 3%）. The fingerprints

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便功效，用于瘡癰、風(fēng)疹瘙癢、久瘧體虛、腸燥便秘等[1]。目前市售何首烏存在偽品、摻偽、染色等問(wèn)題，影響何首烏的臨床應(yīng)用[2]，因此，制定相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)十分關(guān)鍵。何首烏主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類等化合物[3-11]。本研究以二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸為指標(biāo)成分，采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地的何首烏樣品進(jìn)行含量測(cè)定，比較不同產(chǎn)地何首烏之間的差異，并建立HPLC指紋圖譜分析方法，為江蘇省中醫(yī)院何首烏藥材基地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化種植與加工提供數(shù)據(jù)支持，為藥監(jiān)部門對(duì)何首烏進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控提供參考方法，并為2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考。

1? 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（G4212B型二極管陣列檢測(cè)器，G1312B型二元泵，G1367E型高性能自動(dòng)進(jìn)樣器，G1322A型脫氣機(jī)，G1316A型柱溫箱），BP211D型精密電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司），OHAUS AX224ZH/E型電子分析天平（蘇州賽恩斯儀器有限公司），KQ-6200H型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

沒(méi)食子酸（批號(hào)141109）、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（二苯乙烯苷，批號(hào)16081506）、大黃素（批號(hào)151008）、大黃素甲醚（批號(hào)17022010），成都普菲德生物技術(shù)有限公司有限公司，純度≥98%;1，2，3，4，6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖（五沒(méi)食子酰葡萄糖，批號(hào)lw16041905，純度≥98%），南京良瑋生物科技有限公司;大黃酚（批號(hào)c1724029）、蘆薈大黃素（批號(hào)380041）、大黃酸（批號(hào)951089），北京百靈威科技有限公司，純度≥98%。甲醇、乙腈為色譜純，德國(guó)默克試劑有限公司;水為超純水，其他試劑均為分析純。

何首烏樣品由安徽井泉中藥飲片有限公司、安徽萬(wàn)生中藥飲片有限公司、貴州同德藥業(yè)中藥飲片有限公司、安徽協(xié)和成藥業(yè)中藥飲片有限公司幫助收集，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院朱育鳳主任中藥師鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，見(jiàn)表1。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.1.1? 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液;按表2程序進(jìn)行梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2? 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取適量沒(méi)食子酸、五沒(méi)食子酰葡萄糖、大黃素、二苯乙烯苷（避光）、大黃素甲醚對(duì)照品，加適量甲醇溶解，制成濃度分別為1.26、1.91、1.98、5.21、1.96 mg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.1.3? 供試品溶液的制備

取何首烏細(xì)粉（過(guò)80目篩）約2.0 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入90%甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?80 W，頻率50 Hz）45 min，放冷，稱重，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.20 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4? 線性關(guān)系考察

取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，混合后，等比逐級(jí)稀釋，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3。各成分相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4，在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 ?精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，混合后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，記錄色譜圖。以峰面積計(jì)，五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為2.48%、4.75%、4.31%、1.59%、0.63%，表明儀器精密度良好。

2.1.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取9號(hào)樣品2.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，避光、室溫放置，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)，五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為3.71%、4.26%、1.99%、0.34%、0.43%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取9號(hào)樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)，五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚RSD分別為3.66%、4.71%、2.00%、0.60%、0.35%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8? 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取9號(hào)樣品1.0 g，共6份，加入五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)得各成分平均加樣回收率分別為101.46%、103.64%、103.64%、96.52%、100.45%，RSD分別為0.55%、0.18%、0.42%、0.55%、0.89%，見(jiàn)表4。

2.1.9? 樣品含量測(cè)定

取16批何首烏樣品各約2.0 g，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算指標(biāo)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表5，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2? 不同產(chǎn)地何首烏聚類分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，以4個(gè)不同省份何首烏樣品中的5種指標(biāo)成分為研究對(duì)象。將原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化變換后，采用平方Euclidean距離法計(jì)算樣品間的相似性，選用組間距離法進(jìn)行聚類，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢钥闯?，云南何首烏樣品距離最遠(yuǎn)，其次為安徽樣品，四川與貴州樣品聚為一類。

2.3? 何首烏指紋圖譜的建立

2.3.1? 樣品來(lái)源

2.3.2? 色譜條件

2.3.3? 供試品溶液的制備

2.3.4? 參照峰的選擇

2.3.5? 精密度試驗(yàn)

取何首烏樣品（S9）2.0 g，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，避光、室溫放置，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，以二苯乙烯苷為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積，其RSD均小于4.36%。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行分析，各樣品色譜圖之間的相似度為1，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.3.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取何首烏樣品（S9）2.0 g，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，避光、室溫放置，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積，其RSD均小于4.71%。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件進(jìn)行分析，各樣品色譜圖之間的相似度為1，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7? 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取14批何首烏樣品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件進(jìn)行分析。以S1樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正方法匹配色譜圖，通過(guò)中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，共確定了18個(gè)共有峰。采用對(duì)照品對(duì)照，確定了2、4、7、17、18號(hào)峰分別為五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚（見(jiàn)圖3、圖4）。采用中位數(shù)法導(dǎo)出14份樣品的共有模式與相似度評(píng)價(jià)（見(jiàn)表7、表8）。14份樣品中有11份相似度大于0.90，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定;其中S9、S10、S12相似度低于0.90，質(zhì)量稍差。

4? 討論

在流動(dòng)相選擇上，本試驗(yàn)比較了甲醇-水與乙腈-0.1%磷酸水溶液[5]，結(jié)果當(dāng)流動(dòng)性為乙腈-0.1%磷酸水溶液時(shí)，各成分峰形及分離度較好，故選用乙腈- 0.1 %磷酸水溶液作為流動(dòng)相。

在供試品溶液制備中，本試驗(yàn)比較了70%、80%、90%、100%甲醇作為提取溶劑在相同環(huán)境條件下的提取效果，通過(guò)進(jìn)樣分析，比較各成分的峰面積，發(fā)現(xiàn)90%甲醇作為提取溶劑時(shí)效果最佳，故選用90%甲醇作為提取溶劑。

由指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果可知，何首烏主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類，其中，蒽醌類化合物主要為大黃素和大黃素甲醚，而大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素含量極低甚至難以測(cè)出;此外，何首烏中還含有少量五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸。由表5可知，貴州、安徽、四川產(chǎn)地的何首烏樣品中的二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚含量均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定;云南產(chǎn)地何首烏樣品中未檢測(cè)出二苯乙烯苷類及蒽醌類成分，不符合藥典規(guī)定。由圖1、圖2可以看出，云南產(chǎn)地何首烏樣品峰形與其他產(chǎn)地的何首烏樣品存在顯著差異，推測(cè)云南產(chǎn)地的何首烏可能是其同屬近源物種。安徽阜陽(yáng)的何首烏樣品中五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷及大黃素甲醚的含量最高（分別為0.048 9%、0.036 1%、3.179 9%、0.551 2%）;貴州的何首烏樣品中大黃素含量最高（0.423 8%）。指標(biāo)性成分平均總含量最高的為安徽阜陽(yáng)樣品（3.966 6%），其次為安徽亳州、貴州、四川樣品（2.769 8%、2.469 4%、2.306 3%）。聚類分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地何首烏之間有一定差異，云南產(chǎn)何首烏與其他產(chǎn)地樣品差異顯著，與含量測(cè)定結(jié)果相符;安徽產(chǎn)何首烏與四川、貴州樣品差異也較大，四川與貴州樣品接近，可歸為一類，這與各地區(qū)地理位置存在一定相關(guān)性。

本試驗(yàn)建立了何首烏HPLC指紋圖譜，確定了18個(gè)共有峰，指認(rèn)了何首烏中的五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚5個(gè)化學(xué)成分。通過(guò)使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件分析，14批樣品中有11批相似度>0.90，S9、S10、S12相似度<0.90，表明大部分何首烏樣品質(zhì)量較穩(wěn)定，少數(shù)樣品質(zhì)量有待提高。指紋圖譜的建立有助于優(yōu)化何首烏的質(zhì)量控制方法，可應(yīng)用于何首烏的質(zhì)量檢測(cè)。

綜上所述，本試驗(yàn)測(cè)定了16批不同產(chǎn)地的何首烏樣品中五沒(méi)食子酰葡萄糖、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚5種指標(biāo)性成分的含量，通過(guò)使用SPSS19.0軟件進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)云南產(chǎn)何首烏樣品為同屬近源種，不能作為何首烏藥材使用，且何首烏指標(biāo)成分含量的分布具有一定地域性。本試驗(yàn)采用貴州、四川、安徽何首烏樣品建立了何首烏HPLC指紋圖譜，確定了18個(gè)共有峰，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)》軟件分析發(fā)現(xiàn)，14批樣品中有3批樣品質(zhì)量稍差。本研究建立的指紋圖譜能夠較全面反映何首烏的整體情況。將指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果與指紋圖譜結(jié)合，能較完整地體現(xiàn)何首烏的質(zhì)量。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本方法穩(wěn)定、可靠，重現(xiàn)性好，可作為何首烏質(zhì)量控制的檢測(cè)方法之一。本研究可為何首烏的質(zhì)量控制及2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2018-08-02）

（修回日期：2018-08-29;編輯：陳靜）