甘肅省隴東南大豆孢囊線蟲的發(fā)生和分布

羅寧 李惠霞 郭靜

摘要 為了解甘肅省隴東南地區(qū)大豆孢囊線蟲病分布和發(fā)生程度，采用Z字形取樣法，對甘肅省隴東南地區(qū)9個縣（區(qū)）37個鄉(xiāng)鎮(zhèn)大豆孢囊線蟲病的發(fā)生和分布進行調(diào)查，并根據(jù)形態(tài)特征和rDNAITS序列比對鑒定線蟲種類。共采集土樣411份，隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲檢出率為87.2%，其中鎮(zhèn)原、西峰、正寧、華池和環(huán)縣的檢出率最高，達100%，鎮(zhèn)原孢囊發(fā)生量最大，平均孢囊數(shù)為11.4個/100 g土;隴南地區(qū)大豆孢囊線蟲檢出率為63.7%，成縣和徽縣分別為64.0%、63.0%，平均孢囊數(shù)分別為0.9和1.2個/100 g土。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀測和rDNAITS序列比對，甘肅省隴東南采集到的孢囊線蟲均鑒定為大豆孢囊線蟲Heterodera glycines。

關(guān)鍵詞 大豆孢囊線蟲病; 分布; 發(fā)生; 鑒定

中圖分類號： S 432.45

文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018253

Abstract In order to understand the occurrence and distribution of soybean cyst nematode in southeast of Gansu Province， zigzag sampling method was used to investigate soybean cyst nematodes in 37 townships of 9 counties in southeastern Gansu. The species of nematodes were identified based on the morphological observation and rDNAITS sequence analysis. Totally， 411 samples of soil samples were collected. The results showed that the detection rate of soybean cyst nematodes in eastern Gansu was 87.2%， among which the detection rates in Zhenyuan， Xifeng， Zhengning， Huachi and Huan County were the highest， with the rates of 100%， while that in Qingcheng was the lowest by 39.3%. The highest density was found in Zhenyuan with the average cysts number of 11.4 per 100 g soil. The detection rate of soybean cyst nematodes in southern Gansu was 63.7% and those in Chengxian and Huixian were 64.0% and 63.0%， respectively， and average densities of nematodes were 0.9 and 1.2 per 100 g soil， respectively. Morphological observation and rDNAITS sequence analysis showed that the cyst nematodes collected in southeastern Gansu were identified as Heterodera glycines.

Key words soybean cyst nematode disease; distribution; occurrence; identification

大豆孢囊線蟲Heterodera glycines是豆類生產(chǎn)上的重要線蟲，在世界各主要大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。1899年俄國人雅切夫斯基等在我國黑龍江省西部首次發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲病，隨后巴西、日本、韓國、朝鮮、美國、加拿大、哥倫比亞、印度尼西亞、俄羅斯、埃及等國家相繼報道了大豆孢囊線蟲的發(fā)生[24]。目前，我國黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇、湖北、浙江、上海、新疆、陜西、寧夏和甘肅等地已證實有大豆孢囊線蟲分布[58]。該病一般造成大豆減產(chǎn)5%～10%，嚴重時減產(chǎn)達30%～50%，甚至絕產(chǎn)[5，910]，嚴重制約豆類作物生產(chǎn)安全。

近年來，隨著大豆孢囊線蟲在各地嚴重發(fā)生，貴州、山東、河北、新疆及黑龍江等地對大豆孢囊線蟲開展了較系統(tǒng)的研究，但甘肅省相關(guān)研究的報道較少。葉文興等[11]，Peng等[12]報道在甘肅省發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲，但有關(guān)其發(fā)生情況和危害程度尚缺乏了解。

甘肅省種植大豆區(qū)域廣、歷史久，隴東南是甘肅省大豆主產(chǎn)區(qū)，以種植春播大豆為主，多數(shù)地區(qū)小麥、玉米、大豆進行輪作，少數(shù)夏播大豆是在小麥和油菜收獲后復(fù)種。目前，大豆孢囊線蟲在甘肅省的分布、發(fā)生以及危害情況尚不清楚，一旦大面積發(fā)生，將嚴重影響甘肅地區(qū)大豆的安全生產(chǎn)。本研究擬對甘肅隴東南地區(qū)大豆孢囊線蟲開展調(diào)查研究，以期明確大豆孢囊線蟲病在該地區(qū)的分布、發(fā)生程度，并對病原線蟲種類進行鑒定，為該病害的及時有效防治提供依據(jù)。

1.2 孢囊的分離和計數(shù)

參照李惠霞等[13]的試驗方法，隨機取100 g風(fēng)干后土樣倒入塑料桶內(nèi)，加入自來水攪拌使其泥漿均勻，靜置2～3 min，將上層的懸浮液依次倒入26目和60目的篩網(wǎng)過濾，重復(fù)3～4次。沖洗26目篩網(wǎng)上的殘留物，使孢囊和細渣全部沖入60目篩網(wǎng)中，用小水流從正面輕輕淋洗60目篩。沖洗干凈后，用洗氣瓶沖洗60目網(wǎng)篩上的剩余物質(zhì)至尼龍紗上，編號，在解剖鏡下檢查尼龍紗上的孢囊并計數(shù)，統(tǒng)計孢囊檢出率。

孢囊檢出率=檢測出孢囊的土樣數(shù)/總土樣數(shù)×100%。

1.3 孢囊線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

從各群體中挑選飽滿孢囊，參照馮志新[14]的方法在體視顯微鏡下用鋒利的解剖刀切下陰門錐，用牙簽或者昆蟲針輕輕清除陰門錐內(nèi)側(cè)附著物，轉(zhuǎn)移到40% H2O2中漂白處理4 min。依次轉(zhuǎn)移至70%、95%、100% 乙醇中脫水，制作成臨時玻片。參照王明祖等[15]的方法鑒定孢囊線蟲的種類。

1.4 孢囊線蟲DNA的提取

參照彭德良等[16]的方法提取線蟲DNA。挑取1個飽滿孢囊，放入裝有14 μL滅菌重蒸水的Eppendorf管中，加入3 μL10×PCR buffer（含Mg2+）和3 μL蛋白酶K，在液氮中速凍1 min。用乙醇消毒的玻璃棒快速研磨1～2 min。-20℃冷凍2 h，然后將Eppendorf管在65℃下溫育1.5 h，95℃處理10 min，使蛋白酶K變性，離心1 min，取上清DNA懸浮液放入-20℃保存，備用。

1.5 不同地區(qū)大豆孢囊線蟲群體的rDNAITS擴增及測序分析

采用25 μL的PCR擴增體系[17]：模板DNA 2 μL、通用引物TW81（5′GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3′）和AB28（5′ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3′）各1 μL、10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTPs 1 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補足到25 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性4 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物-20℃保存。取5 μL擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，100 V，30 min，電泳后在紫外燈下觀測、照相。將擴增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進行純化測序，進行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘肅隴東南大豆孢囊線蟲的分布

本試驗采集了甘肅隴東南9個縣（區(qū)）37個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的411份土壤樣品，調(diào)查結(jié)果表明，295份土壤樣品含有孢囊線蟲，孢囊檢出率為71.8%（表2）。所調(diào)查的9縣均有孢囊線蟲分布，其中鎮(zhèn)原、西峰、正寧、華池及環(huán)縣的檢出率最高，達100%。寧縣、徽縣、成縣的孢囊檢出率分別達到98.2%、63%、64%，檢出率最低的是慶城，為39.3%（表2）。

2.2 甘肅隴東南孢囊線蟲發(fā)生程度

由表3可知，甘肅隴東南調(diào)查的9個縣（區(qū)）均有大豆孢囊線蟲發(fā)生，不同地區(qū)大豆孢囊線蟲密度差別較大，同一地區(qū)大豆田的孢囊線蟲發(fā)生程度也存在差異。平均孢囊數(shù)為5.9個/100 g土。鎮(zhèn)原和寧縣孢囊線蟲發(fā)生程度最為嚴重，每100 g土樣平均孢囊數(shù)分別為11.4個和10.7個，個別地塊土樣孢囊數(shù)超過20個;隴南地區(qū)的成縣和徽縣孢囊線蟲發(fā)生程度最輕，每100 g土樣平均孢囊數(shù)分別為1.2個和0.9個，且35%以上的土樣無孢囊檢出，60%以上土樣每100 g土中平均孢囊數(shù)在1～5個之間（表3）。

2.3 孢囊線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

孢囊呈梨形或檸檬形，顏色淺褐色至深褐色（圖1a），長度為663.1 μm（547.0～752.1 μm）;寬度為457.5 μm（343.3～565.0 μm）;陰門錐下方有較多明顯的長形泡狀突，具有雙半膜孔，兩膜孔間有發(fā)育良好的下橋（圖1b），陰門膜孔長度41.4 μm（38.8～43.3 μm）;膜孔寬度40.3 μm（39.3～41.1 μm）;陰門裂長42.4 μm（36.3～47.8 μm）;下橋長89.3 μm（82.1～101.8 μm）。本試驗研究結(jié)果與劉維志等[6]的測量結(jié)果基本一致，將其初步鑒定為大豆孢囊線蟲H.glycines。

2.4 不同地區(qū)大豆孢囊線蟲群體rDNAITS序列分析

對甘肅省隴東南采集的孢囊線蟲群體的rDNAITS進行PCR擴增，均擴增出約1 000 bp的DNA片段（圖2）。選擇具有代表性群體在GenBank中進行同源性比對分析，結(jié)果表明采自隴東西坡（GsXp，MH371304）、玄馬（GsXm，MH371375）、洪得（GsHd，MH371378）、焦作（GsJz，MH375356）、肖金（GsXj，MH375357）、上肖（GsSx，MH375358）、隴南拋沙（GsPs，MH375376）的孢囊線蟲群體rDNAITS序列與來自美國的大豆孢囊線蟲群體（Clone3460）ITS序列（KY794755）相似度達99%;而隴東焦作、隴南拋沙兩個群體的rDNAITS序列與來自我國山東的大豆孢囊線蟲群體（YS1）ITS序列（JQ068764）、伊朗大豆孢囊線蟲群體（Did38）ITS序列（JX024210）相似性達100%。綜上，根據(jù)形態(tài)觀察和ITS序列分析，確定甘肅省隴東南地區(qū)寄生在大豆上的孢囊線蟲均為大豆孢囊線蟲H.glycines。

3 討論

大豆孢囊線蟲屬于孢囊線蟲屬Heterodera，是一種土傳的定居性內(nèi)寄生線蟲，也是具有毀滅性危害的植物線蟲。大豆孢囊線蟲可在顯微鏡下通過觀察孢囊形態(tài)進行鑒別，成熟的孢囊為檸檬形或梨形，淺褐色至深褐色，頸部和尾部有明顯突出，陰門錐雙半膜孔，陰門裂較長，兩膜孔間的下橋明顯[18]。本試驗采集的孢囊線蟲經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和rDNAITS序列分析表明均是大豆孢囊線蟲，與葉文興等[12]的鑒定結(jié)果一致。

大豆孢囊線蟲可通過跨區(qū)作業(yè)的收割器械，水流及沙塵暴等傳播。甘肅與青海、陜西、寧夏和新疆四省相鄰，而新疆、陜西和寧夏均發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲病[19]。2003年，張俊立等[20]在河北省采集大豆根際土壤樣品65份，大豆孢囊線蟲檢出率高達73.93%。宋美靜等[21]對全國20個?。ㄗ灾螀^(qū)）的大豆孢囊線蟲進行調(diào)查，結(jié)果總檢出率達69.4%，其中東北和黃淮海地區(qū)發(fā)生率最高，滄州、長春和黑河地區(qū)檢出率高達100%。黑龍江省35個地區(qū)大豆孢囊線蟲的發(fā)生率高達100%，每年造成的損失高達數(shù)十億元[22]。龍海波等[23]對貴州省大豆孢囊線蟲的發(fā)生和危害進行調(diào)查，結(jié)果表明總檢出率僅為28.2%，但大方縣和赫章縣發(fā)生嚴重，檢出率超過40%。本試驗表明，甘肅省大豆主產(chǎn)地區(qū)大豆孢囊線蟲的發(fā)生較普遍，隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲的檢出率為87.2%，隴南地區(qū)大豆孢囊線蟲的檢出率為63.7%。在本試驗中，慶陽地區(qū)大豆孢囊檢出率高于隴南，可能是由于隴南降雨量遠大于慶陽，而大豆孢囊最適宜孵化的土壤含水量為10%～25%[24]，土壤含水量過高會抑制孢囊線蟲的繁殖;隴南地區(qū)長期實施小麥、馬鈴薯、玉米和大豆輪作種植，也是導(dǎo)致大豆孢囊線蟲發(fā)生率低的原因。

大豆是甘肅隴東南地區(qū)主要經(jīng)濟作物，目前甘肅省種植面積保持在13.33萬～15.33萬hm2，隴東地區(qū)面積最大，達到10萬hm2[25]。本研究表明，隴東地區(qū)檢出率為87.2%，由此可推算出僅隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲病的發(fā)生面積約為8.7萬hm2。甘肅省地處黃土、青藏和蒙古三大高原交匯地帶，氣候類型多樣，且位于黃河上游，沙塵和黃河灌溉水加劇了大豆孢囊線蟲的傳播和蔓延。隴南地區(qū)氣候溫和，屬東亞季風(fēng)氣候;隴東地區(qū)屬半干旱區(qū)，年均降水量500 mm，是典型大陸性氣候，適宜大豆孢囊線蟲病發(fā)生。

大豆孢囊線蟲病是一種積年流行病害，且病情逐年加重。在實際生產(chǎn)中種植抗耐病品種輪作、噴施化學(xué)藥劑及生物防治等措施均對大豆孢囊線蟲病有一定的防治作用[26]，但這些措施都存在局限性，輪作周期長，在有限的耕地資源內(nèi)不易實現(xiàn)，生物防治在大田中不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響，常用殺線劑成本較高且污染環(huán)境，農(nóng)戶難以接受。大豆孢囊線蟲理論上存在16個生理小種[27]，連續(xù)種植抗病品種會改變生理小種，導(dǎo)致育種的難度增加。因此，應(yīng)進一步研究甘肅省大豆孢囊線蟲的侵染規(guī)律、生理小種類型，探明該病害防治關(guān)鍵期，通過田間試驗篩選出生防制劑和高效低毒的殺線劑，為今后甘肅省大豆孢囊線蟲的防治奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 陳雙.大豆孢囊線蟲生理小種鑒定及其致病性研究[D].哈爾濱：黑龍江大學(xué)，2015.

[2] LIU Xingzhong，LI Jianqiang，ZHANG Dongsheng. History and status of soybean cyst nematode in China [J].International Journal of Nematology，1997，7（1）：1825.

[3] 馬朝旺，段玉璽，陳立杰，等.遼寧省大豆孢囊線蟲生理分化研究[J].大豆科學(xué)，2009，28（2）：285289.

[4] MAAFI Z，SALATI T M，RIGGS R D. Distribution，population density，race and type determination of soybean cyst nematode，Heterodera glycines，in Iran [J].Nematology，2008，10（6）：919924.

[5] 劉維志.植物病原線蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：281294.

[6] 劉維志，劉畔，段玉璽，等.中國大豆孢囊線蟲的形態(tài)學(xué)觀察[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，25（2）：164167.

[7] ZHENG Junye，ZHANG Youni，LI Xianpei. First report of the soybean cyst nematode，Heterodera glycines，on soybean in Zhejiang，Eastern China [J].Plant Disease，2009，93（3）：319.

[8] 李克梅，日孜枉古麗，董艷秋.新疆大豆孢囊線蟲病的初步研究[J].植物保護，2014，40（2）：132134.

[9] 張玉華.大豆孢囊線蟲病的危害與防治[J].大豆通報，1995（5）：2627.

[10]王守義.抗大豆孢囊線蟲病種質(zhì)資源的篩選與創(chuàng)新[J].大豆通報，1995（4）：1314.

[11]葉文興，彭德良，黃文坤，等.甘肅首次發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）[C]∥中國植物保護學(xué)會.病蟲害綠色防控與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全——中國植物保護學(xué)會2015年學(xué)術(shù)年會論文集，2015：1.

[12]PENG Deliang，PENG Huan，WU Duqing，et al. First report of soybean cyst nematode （Heterodera glycines） on soybean from Gansu and Ningxia China [J]. Plant Disease，2015，100（1）： 229.

[13]李惠霞，劉永剛，朱銳東，等.甘肅省小麥禾谷孢囊線蟲的發(fā)生及分布[J].植物保護，2016，43（3）：170174.

[14]馮志新.植物線蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：132135，176.

[15]王明祖，彭德良，武學(xué)勤.小麥孢囊線蟲病的研究Ⅰ：病原鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1991，10（4）：352356.

[16]彭德良，SUBBTIN S，MOENS M.小麥禾谷孢囊線蟲（Heterodera avenae）的核糖體基因（rDNA）限制性片段長度多態(tài)性研究[J].植物病理學(xué)報，2003，33（4）：323329.

[17]SZALANSKI A，SUI D D，HARRIS T S，et al. Identification of cyst nematodes of agronomic and regulatory concern with PCRRFLP of ITS1 [J].Journal of Nematology，1997，29（4）：255267.

[18]PERRY R N，MOENS M. Plant nematology [M]. 簡恒，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011：9798.

[19]宋美靜.我國大豆孢囊線蟲群體致病性分化及其輔助鑒別寄主的發(fā)掘[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[20]張俊立，彭德良，曹克強.河北省大豆孢囊線蟲分子鑒定及其分布[J].植物保護，2005，31（1）：4043.

[21]宋美靜，朱曉峰，王東，等.我國大豆主產(chǎn)區(qū)大豆孢囊線蟲群體分布及致病性分化研究[J].大豆科學(xué)，2016，35（4）：630636.

[22]孫玉秋，徐艷麗，李春杰，等.黑龍江省大豆孢囊線蟲種群分布和卵密度研究[J].大豆科學(xué)，2011，30（2）：250253.

[23]龍海波，陳文，裴月令，等.貴州省大豆孢囊線蟲的發(fā)生與分布[J].植物保護，2017，43（6）：173176.

[24]孫晶雙，鄭雅楠，段玉璽，等.溫度、光照和土壤含水量對大豆孢囊線蟲休眠卵孵化的影響[J].大豆科學(xué)，2009，28（4）：690692.

[25]劉冰.大豆孢囊線蟲病的發(fā)生條件及防治措施[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（3）：186.

[26]RIGGS R D，SCHMITT D P，Noel G R.Variability in race tests with Heterodera glycines[J]. Journal of Nematology，1988，20：565 572.

（責(zé)任編輯：楊明麗）