回歸正交設計對密蒙花總黃酮提取工藝參數(shù)優(yōu)化建模

陳菊 劉書華

【摘 要】? 目的：研究黔東南當?shù)孛苊苫傸S酮超聲提取最佳工藝參數(shù)。方法：采用單因素及二次回歸正交試驗設計優(yōu)化密蒙花總黃酮提取工藝條件，用紫外分光光度法測定總黃酮的含量。結(jié)果：密蒙花總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：固液比為1∶33（g/mL），乙醇濃度為54%，提取時間為40min。結(jié)論：使用回歸正交設計能合理地優(yōu)化密蒙花總黃酮的提取工藝，為密蒙花的開發(fā)利用提供參考。

【關鍵詞】 密蒙花;總黃酮;二次回歸正交設計

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）4-0024-05

Abstract：Objective The aims of this? research was to optimize the extraction technology of total flavonoid from Qiandongnan local Buddleia officinalis Maxim. Methods The extraction process conditions of the total flavonoids were optimized by single factor design and quadratic regression orthogonal design. The content of the total flavonoids was detected by UV Spectroscopy. Results The optimal extraction conditions were determined as follows：ethanol concentration 54%， Solid/liquid ratio（g/mL ）1∶33， and extraction time 40min.Conclusion The experimental method can optimize the technique and it also provides reference for the development and utilization of Buddleia officinalis Maxim.

Keywords：Buddleia officinalis Maxim.;Total Flavanoids;Quadratic Regression Orthogonal Design

密蒙花為馬錢科醉魚草屬植物密蒙花（Buddleia officinalis Maxim.） 的干燥花蕾和花序[1]，又稱做黃飯花、染飯花、小錦花、雞骨頭花等，是一種常用中藥，主要用于目赤腫痛、多淚澀明、目生翳膜、肝虛目暗、視物昏花等癥[2]。在貴州黔東南地區(qū)，每逢過節(jié)有用密蒙花新鮮或干燥花蕾和花序的水浸液染糯米飯食用的習俗。文獻報道[3]，密蒙花的主要活性成分為黃酮類、苯乙醇苷類、三萜及其皂苷類化合物，其中黃酮類化合物是密蒙花的主要活性成分之一，現(xiàn)代研究表明[4-5]，密蒙花中的黃酮類成分達11種，具有抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等作用。有關黔東南地區(qū)密蒙花中黃酮類成分提取工藝及其在醫(yī)藥行業(yè)中利用價值的開發(fā)研究比較少，本研究采用二次回歸正交試驗設計對超聲提取密蒙花總黃酮成分的工藝條件進行優(yōu)化，為密蒙花資源的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 UV8000S紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），潔康超聲波清洗器（潔康超聲波設備有限公司） ，MS204S型電子分析天平（ 梅特勒托利多（上海）儀器有限公司）。

1.2 材料與藥品 密蒙花采自黔東南州境內(nèi)，曬干，粉碎后備用;蘆丁標準品（批號：Y19N7S25244，上海源葉生物科技有限公司），無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣品總黃酮提取液制備 準確稱取密蒙花粗粉1.0g若干份，置具塞錐形瓶中，加25mL石油醚，超聲提取15min，濾過，棄去石油醚液，藥渣晾干后，按單因素試驗及正交組合試驗設計方案，加一定倍量和濃度的乙醇，超聲提取，將提取液過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加相應濃度乙醇定容，即得密蒙花總黃酮提取液。

1.3.2 標準曲線的繪制 稱取10℃下干燥至恒重的蘆丁標準品10mg，用無水乙醇溶解并定溶到50mL容量瓶中，搖勻，得0.2mg/mL標準溶液。精密吸取上述標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別放入20mL 的容量瓶中，先各加入5 %NaNO2 溶液0.5mL，搖勻，靜置6min后，分別加入10 %Al（NO3）3 溶液0.5mL，搖勻，放置6min后，再分別加入4 %的NaOH 溶液5mL，用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min后，在510nm 處測定吸光度值。以吸光度A為縱坐標，蘆丁標準溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標， 繪制標準曲線，并擬合蘆丁標準曲線的回歸方程為： A=0.005+11.892C（r=0. 999） ，表明黃酮在0.000～0.030mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度A呈線性關系，標準曲線如圖1所示。

1.3.3 總黃酮含量計算??? 精密吸取密蒙花總黃酮提取液0.5mL置于20mL容量瓶，按“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510nm 處測定吸光度，根據(jù)標準曲線回歸方程，求出相當于樣品吸光度的蘆丁濃度，按下式計算總黃酮含量：

總黃酮含量（mg/g）=C×V×稀釋倍數(shù)m?式中C為樣品中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），V為黃酮溶液的體積50mL，稀釋倍數(shù)為40倍，m為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4 單因素試驗 按表1設計的因素水平超聲提取，分別考察單因素乙醇濃度、固液比、提取時間對密蒙花總黃酮含量的影響。

1.3.5 回歸正交組合試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對影響密蒙花總黃酮含量的三因素，乙醇濃度（x1），固液比（x2）、提取時間（x3）進行二次回歸正交組合試驗。由于因素數(shù)m=3，二水平試驗次數(shù)mc=8，星號試驗次數(shù)mr=2m=6，零水平試驗次數(shù)m0=3，根據(jù)星號臂長公式計算，得r=1.353。因素水平編碼如表2 所示 。按“1.3.2”節(jié)法測定密蒙花總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗 取蘆丁對照品溶液，按“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510nm波長處連續(xù)測定6次，吸光度的RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

2.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，按“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510nm波長處，按0、1、2、4、6、8h不同時間間隔測定吸光度，計算吸光度的RSD為1.22%，表明供試樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 重復性試驗 稱取6份同樣的樣品約1.0g，按樣品溶液制備方法處理，“1.3.2” 節(jié)中顯色法顯色，在510nm 處測定吸光度，計算RSD為1.04%，表明測定方法重復性好。

2.4 加樣回收試驗 稱取6份已知含量的密蒙花藥材粉末約0.5 g，分別加入蘆丁對照品適量，按樣品溶液制備方法處理，進行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表3，平均回收率為101.46%，RSD為2.31%，表明該方法準確度較高。

2.5 單因素試驗

2.5.1 提取溶劑乙醇濃度的影響 隨著乙醇濃度的升高，密蒙花中黃酮含量逐漸增加，當乙醇濃度為60%時，黃酮含量最高，繼續(xù)增加乙醇濃度，含量反而下降。如圖2所示。

2.5.2 固液比的影響 料液比為1∶[KG-*3/5]40時，黃酮含量最高，但隨著溶劑用量的增加，黃酮含量呈下降趨勢，因此，不需要繼續(xù)提高溶劑用量。如圖3所示。

2.5.3 提取時間的影響 由圖4可見，提取時間為30min時，黃酮含量最高，當再延續(xù)提取時間，黃酮含量明顯下降。如圖4所示。

2.6 回歸正交組合試驗 按照表2安排的試驗水平進行超聲提取，按照三元二次回歸正交組合設計的統(tǒng)計方法進行分析，得出密蒙花中總黃酮含量（Y）與各因素間的回歸方程為：

2.7 模型尋優(yōu) 對剔除不顯著項變量后的回歸方程（2）式求一階偏導數(shù)，解方程組得x1=-0.4535，x3=-0.2212。將x1和x3代入原編碼水平，得出各因素的最優(yōu)試驗水平為x1=53.30≈54，x3=32.5≈33。由試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計計算結(jié)果可知，因素x1（乙醇濃度）和因素x3（固液比）對提取物中總黃酮含量有影響，而x2（提取時間）的影響不顯著，綜合考慮，取x2=r=1.353，代入原編碼水平計算得。即最佳的提取工藝條件是用33倍量54%的乙醇超聲提取密蒙花40min。

2.8 驗證試驗 按上述最佳提取工藝進行試驗驗證（n=3），提取物中總黃酮含量平均值為70.13mg/g，表明所確定的最佳提取工藝合理可行。

3 結(jié)論

回歸正交試驗設計是把正交試驗設計、回歸數(shù)據(jù)處理和回歸精度統(tǒng)一起來的回歸設計與分析方法，兼?zhèn)淞苏辉O計與回歸分析兩者的優(yōu)點。不僅可以找到與試驗點較為貼近的數(shù)學模型，而且減少了試驗次數(shù)，數(shù)據(jù)分析上的計算也很簡潔，對實際應用有很好的指導意義。利用超聲法提取密蒙花總黃酮具有提取率高，縮短提取時間，并且避免高溫對黃酮類成分的破壞。本試驗以提取物中總黃酮含量為評價指標，采用二次回歸正交組合設計，確定密蒙花中總黃酮含量的最佳提取工藝條件為乙醇濃度54%，固液比1∶[KG-*3/5]33（g：mL），提取時間40min，在此條件下提取的黃酮含量達70.13mg/g。并擬合出了密蒙花總黃酮提取與各因素變量的回歸方程數(shù)字模型，模型擬合較好，達極顯著水平，有一定的應用價值。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：329.

[2]田碩，苗明三.密蒙花的現(xiàn)代研究[J].中醫(yī)學報，2014，29（5）：708-710.

[3]石璐，謝國勇，王颯，等.密蒙花的藥學研究進展[J]. 中國野生植物資源，2016，36（5）：34-38.

[4]謝國勇，石璐，王颯，等.密蒙花化學成分的研究[J].中國藥學雜志，2017，52（21）：1839-1822.

[5]鄭暢，阮靜雅，瞿璐，等.密蒙花中黃酮類成分的分離與鑒定[J].中國藥物化學雜志，2018，28（2）：52-57.

（收稿日期：2018-12-14 編輯：程鵬飛）