番石榴葉化學(xué)成分分離鑒定及psiguadial D的抗癌活性研究

任善亮，吳 茂，徐露林，劉曉聰，雷思敏，海 萍，楊小龍2,*，高 原*

1宜賓學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，宜賓 644000；2中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430074；3重慶大學(xué)藥學(xué)院創(chuàng)新藥物研究中心，重慶 401331

番石榴(Psidiumguajava)是桃金娘科(Myrtaceae)番石榴屬植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，民間用于治療炎癥、糖尿病、高血壓、發(fā)熱、嘔吐、腹瀉[1-3]。番石榴葉是一種次生代謝產(chǎn)物具有極高“創(chuàng)造系數(shù)”和顯著活性的生物資源。文獻(xiàn)研究表明，含有3,5-二甲?；S基間苯三酚特征結(jié)構(gòu)單元的混源雜萜是從該植物葉中發(fā)現(xiàn)的一類特有結(jié)構(gòu)，這種芐基間苯三酚結(jié)構(gòu)單元能夠與萜烯、黃酮雜合形成多種新穎骨架[3-14]，其中g(shù)uajadial[7]、psiguadial A[7]、psiguadial B[7]、psiguadial C[8]、psiguadial D[8]對(duì)人體肝癌細(xì)胞HepG2顯示出很強(qiáng)的抑制作用(IC50=45.62～157.90 nmol/L)。為進(jìn)一步研究番石榴的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對(duì)我國(guó)云南產(chǎn)番石榴葉的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離，得到了13個(gè)化合物，分別鑒定為4,5-diepipsidial A(1)、psidial A(2)、guajadial(3)、psiguadial A(4)、psiguadial D(5)、α-生育酚(6)、亞油酸(7)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷(8)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(9)、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(10)、β-谷甾醇(11)、兒茶素(12)、沒食子酸(13)。其中，化合物1為首次從天然產(chǎn)物中分離得到，化合物5對(duì)5種人體腫瘤細(xì)胞株HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480顯示出較為明顯的抑制活性。

1 儀器和材料

1.1 儀器與試劑

核磁共振光譜儀(Bruker AV-400 MHz和AV-500 MHz)；ZF-1型紫外檢測(cè)儀(力辰儀器科技有限公司生產(chǎn))；RE52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-3型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司)；FA1604A型電子分析天平(河南恒信儀器設(shè)備有限公司)；HSGF254薄層層析硅膠厚制備板(HPTLC,8 ± 2 μm ≥ 80%,0.4～0.5 mm，煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；柱層析正相硅膠(200～300目，青島海浪硅膠干燥劑有限公司)；半制備型HPLC(AS20005,Dubhe C18column,10 μm,20 × 250 mm，江蘇漢邦科技有限公司)；Sephadex LH-20(Amersham Biosciences,Sweden)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

番石榴葉于2017年9月采自云南省麗江市華坪縣大興鄉(xiāng)，原植物由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所陳渝鑒定為桃金娘科番石榴屬植物番石榴Psidiumguajava，樣品標(biāo)本存放于宜賓學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院。

2 提取與分離

干燥的番石榴葉5 kg，用95%甲醇在室溫下浸泡提取3次，每次48 h；合并濃縮后，得到浸膏500 g。用硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯(95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，0∶100，甲醇)梯度洗脫，TLC檢測(cè)合并后得到10個(gè)組分Fr 1-10。Fr 2經(jīng)反復(fù)硅膠(石油醚-乙酸乙酯，100∶1→20∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱色譜，及TLC(石油醚-乙酸乙酯-甲酸，50∶2∶0.1)制備，得到化合物1(4 mg)、2(14 mg)、3(45 mg)、4(48 mg)、5(3 mg)。Fr 3經(jīng)過正相硅膠(石油醚-乙酸乙酯，20∶1→5∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析分離，得到化合物6(22 mg)和7(54 mg)。Fr 4經(jīng)正相硅膠(石油醚-乙酸乙酯，5∶1)柱層析分離，得到化合物11(716 mg)。Fr 5經(jīng)過正相硅膠(二氯甲烷-甲醇，20∶1→6∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析分離，得到化合物12(68 mg)和13(144 mg)。Fr 8經(jīng)過正相硅膠(二氯甲烷-甲醇，10∶1→5∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析，及HPLC(甲醇-水，40%→65%，0 min→30 min，10 ml/min)制備分離，得到化合物8(5 mg，tR=22.3 min)、9(4 mg，tR=22.9 min)、10(6 mg，tR=24.0 min)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ: 13.48 (1H,s,5′-OH),13.09 (1H,s,7′-OH),10.08 (1H,s,H-14′),10.07 (1H,s,H-15′),7.17～7.30 (5H,m,H-9′,H-10′,H-11′,H-12′,H-13′),4.60 (1H,s,H-15a),4.59 (1H,s,H-15b),3.42 (1H,d,J=10.3 Hz,H-1′),2.29 (1H,dt,J=10.3,4.8 Hz,H-5),2.20 (1H,m,H-9),2.16 (1H,m,H-3a),2.04 (1H,dd,J=13.3,9.2 Hz,H-7a),1.80 (1H,dt,J=14.7,3.9 Hz,H-3b),1.69 (1H,m,H-6a),1.64 (1H,dd,J=10.6,8.2 Hz,H-10a),1.56 (1H,m,H-2a),1.56 (1H,m,H-10b),1.54 (1H,m,H-1),1.47 (1H,m,H-6b),1.20 (3H,s,H3-14),1.05 (1H,m,H-7b),0.99 (6H,s,H3-12,H3-13);13C NMR (CDCl3,125 MHz) (:192.2 (d,C-14′),191.5 (d,C-15′),169.4 (s,C-7′),168.4 (s,C-5′),163.6 (s,C-3′),154.9 (s,C-8),144.1 (s,C-8′),128.4 (s,C-10′,C-12′),128.0 (s,C-9′,C-13′),126.4 (s,C-11′),109.6 (t,C-15),104.9 (s,C-2′),104.2 (s,C-6′),104.1 (s,C-4′),84.7 (s,C-4),57.4 (d,C-1),44.3 (d,C-1′),43.8 (d,C-5),42.1 (d,C-9),38.7 (t,C-10),38.2 (t,C-3),37.2 (t,C-7),33.6 (t,C-6),33.2 (s,C-11),29.5,22.42 (d,C-12,C-13),22.36 (s,C-2),20.1 (s,C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照基本一致，故確定化合物1為4,5-diepipsidial A。

化合物2白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.43 (1H,s,H-7′),13.09 (1H,s,H-5′),10.14 (1H,s,H-15′),10.10 (1H,s,H-14′),7.26 (2H,t,J=7.0 Hz,H-10′,H-12′),7.23 (1H,t,J=7.0 Hz,H-11′),7.15 (2H,d,J=7.2 Hz,H-9′,H-13′),5.03 (1H,s,H-15b),5.00 (1H,s,H-15a),4.18 (1H,d,J=5.7 Hz,H-1′),2.57 (1H,dt,J=3.8,13.5 Hz,H-7b),2.42 (1H,m,H-9),2.27 (1H,brd,J=13.5 Hz,H-7a),2.10 (1H,dd,J=13.9,9.3 Hz,H-3b),2.05 (1H,ddd,J=9.5,5.7,2.0 Hz,H-5),1.79 (1H,t,J=10.1 Hz,H-10a),1.62 (1H,m,H-2a),1.60 (1H,m,H-10b),1.53 (1H,m,H-3a),1.47 (1H,m,H-1),1.44～1.62 (2H,m,H2-6),1.38 (1H,m,H-2b),1.16 (3H,s,H3-14),0.98 (3H,s,H3-12),0.96 (3H,s,H3-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6,15]對(duì)照基本一致，故確定化合物2為psidial A。

化合物3白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.44 (1H,s,5′-OH),13.06 (1H,s,7′-OH),10.09 (1H,s,H-14′),10.06 (1H,s,H-15′),7.12～7.28 (3H,m,H-10′,H-11′,H-12′),7.11 (2H,d,J=7.2 Hz,H-9′,H-13′),4.54 (1H,s,H-15a),4.03 (1H,s,H-15b),3.38 (1H,d,J=10.3 Hz,H-1′),2.32 (1H,m,H-9),2.23 (1H,m,H-5),2.16 (1H,m,H-3a),1.97 (1H,m,H-3b),1.80～2.00 (4H,m,H-1,H2-7,H-2a),1.68 (1H,m,H-6a),1.50～1.65 (3H,m,H-6b,H2-10),1.45 (1H,m,H-2b),1.26 (3H,s,H3-14),1.01 (3H,s,H3-12),0.98 (3H,s,H3-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照基本一致，故確定化合物3為guajadial。

化合物4白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.77 (1H,s,5′-OH),13.54 (1H,s,7′-OH),10.38 (1H,s,H-14′),10.11 (1H,s,H-15′),7.21 (2H,m,H-10′,H-12′),7.13 (2H,m,H-9′,H-13′),7.11 (1H,m,H-11′),4.48 (1H,s,H-1′),2.49 (1H,m,H-10),2.34 (1H,d,J=11.3 Hz,H-5),2.01 (1H,m,H-2a),1.93 (1H,m,H-9β),1.90 (1H,m,H-3a),1.88 (1H,m,H-2b),1.83 (1H,m,H-8β),1.74 (1H,m,H-9α),1.63 (1H,m,H-3b),1.25 (1H,m,H-8α),1.12 (3H,s,H3-15),1.09 (3H,d,J=7.1 Hz,H3-14),0.90 (3H,s,H3-12),0.57 (1H,m,H-7),0.28 (1H,t ,J=10.3 Hz,H-6),0.22 (3H,s,H3-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]對(duì)照基本一致，故確定化合物4為psiguadial A。

化合物5白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.60 (1H,s,5′-OH),13.15 (1H,s,7′-OH),10.10 (1H,s,H-14′),10.08 (1H,s,H-15′),7.32 (2H,m,H-12′,H-13′),7.23 (1H,m,H-11′),7.15 (1H,t,J=7.4 Hz,H-10′),6.78 (1H,d,J=7.7 Hz,H-9′),5.27 (1H,brd,J=11.2 Hz,H-1),4.36 (1H,s,H-1′),3.70 (1H,d,J=7.1 Hz,H-5),2.75 (1H,m,H-2a),2.08 (1H,m,H-2b),2.08 (2H,m,H2-9),1.90 (1H,brd,J=13.3 Hz,H-8a),1.70 (3H,s,H3-14),1.18 (3H,s,H3-12),1.11 (3H,s,H3-13),0.96 (1H,d,J=13.3 Hz,H-8b),0.92 (1H,t,J=7.7 Hz,H-6),0.70 (3H,s,H3-15),0.65 (1H,t,J=9.7 Hz,H-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]對(duì)照基本一致，故確定化合物5為psiguadial D。

化合物6無(wú)色油狀物(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:4.17 (1H,s,2-OH),2.61 (2H,t,J=6.6 Hz,H2-8),2.16 (3H,s,H3-2′),2.11 (6H,s,H3-1′,H3-3′),1.23 (3H,s,H3-4′),0.87 (6H,d,J=6.5 Hz,H3-13′′,H3-16′′),0.85 (3H,d,J=6.5 Hz,H3-14′′),0.84 (3H,d,J=6.5 Hz,H3-15′′);13C NMR (CDCl3,100 MHz)δ:145.5 (s,C-4a),144.5 (s,C-2),122.6 (s,C-4),121.0 (s,C-3),118.4 (s,C-1),117.3 (s,C-8a),74.5 (d,C-6),39.8 (s,C-1′′),39.4 (s,C-11′′),37.4,37.4,37.4,37.3 (d,C-3′′,C-5′′,C-7′′,C-9′′),32.8 (s,C-8′′),32.7 (s,C-4′′),31.5 (s,C-7),28.0 (d,C-12′′),24.8 (s,C-6′′),24.4 (s,C-10′′),23.8 (d,C-4′),22.7 (d,C-16′′),22.6 (s,C-13′′),21.0 (d,C-2′′),20.7 (s,C-8),19.74,19.65 (s,C-14′′,C-15′′),12.2 (s,C-2′),11.8 (s,C-1′),11,3 (s,C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照基本一致，故確定化合物6為α-生育酚。

化合物7無(wú)色油狀物(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.28～5.43 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),2.77～2.83 (2H,m,H2-11),2.35 (2H,t,J=7.3 Hz,H2-2),2.00～2.11 (4H,m,H2-8,H2-14),1.63 (2H,t,J=6.0 Hz,H2-3),1.20～1.40 (14H,m,7×CH2),0.87 (3H,t,J=6.0 Hz,H3-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照基本一致，故確定化合物7為亞油酸。

化合物9黃色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.73 (1H,brs,H-2′),7.57 (1H,brd,J=8.0 Hz,H-6′),6.86 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.39 (1H,brs,H-8),6.19 (1H,brs,H-6),5.15 (1H,d,J=7.0 Hz,H-1′′),3.89 (1H,t,J=7.3 Hz,H-2′′),3.82 (1H,m,H-5′′a),3.80 (1H,m,H-4′′),3.63 (1H,brd,J=7.4 Hz,H-3′′),3.43 (1H,brd,J=11.1 Hz,H-5′′b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]對(duì)照基本一致，故確定化合物9為槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物10黃色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.52 (1H,brs,H-2′),7.48 (1H,brd,J=8.2 Hz,H-6′),6.89 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.38 (1H,brs,H-8),6.19 (1H,brs,H-6),5.46 (1H,s,H-1′′),4.32 (1H,s,H-1′′),3.44～4.37 (5H,m,H-1′′-H-5′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]對(duì)照基本一致，故確定化合物10為槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。

化合物11無(wú)色針晶(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.33 (1H,m,H-6),3.50 (1H,m,H-3),0.99 (3H,s,H3-19),0.91 (3H,d,J=6.2 Hz,H3-21),0.79～0.86 (9H,m,H3-26,H3-27,H3-29),0.66 (3H,s,H3-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對(duì)照基本一致，故確定化合物11為β-谷甾醇。

化合物12白色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.83 (1H,brs,H-2′),6.75 (1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),6.71 (1H,brd,J=8.8 Hz,H-6′),5.92 (1H,brs,H-8),5.84 (1H,brs,H-6),4.55 (1H,d,J=7.4 Hz,H-2),3.96 (1H,m,H-3),2.84 (1H,m,H-4α),2.49 (1H,m,H-4β)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]對(duì)照基本一致，故確定化合物12為兒茶素。

化合物13白色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.05 (2H,s,H-2,H-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]對(duì)照基本一致，TLC檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照品沒食子酸一致，故確定化合物13為沒食子酸。

4 抗癌活性測(cè)定

采用MTS法[10]評(píng)價(jià)化合物5對(duì)人體腫瘤細(xì)胞株HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的體外活性。用含10%胎牛血清培養(yǎng)液(DMEM或RMPI1640)配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5 000～10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，貼壁細(xì)胞提前12 h接種培養(yǎng)。加入待測(cè)化合物溶液(固定濃度40 μM初篩，在該濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在50%附近的化合物設(shè)5個(gè)濃度進(jìn)入梯度復(fù)篩)，每孔終體積200 μL，每種處理均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加MTS溶液20 μL以及培養(yǎng)液100 μL。繼續(xù)孵育1～4 h，使反應(yīng)充分進(jìn)行。選擇490 nm波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad 680)讀取各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，應(yīng)用兩點(diǎn)法(Reed and Muench法)計(jì)算化合物的IC50值，結(jié)果見表1。

表1 化合物5的細(xì)胞毒活性(IC50,μM)Table 1 Cytotoxicity data of compound 5 (IC50,μM)

由表1可以看出，化合物5對(duì)所有人體腫瘤細(xì)胞株均顯示出較為明顯的抑制活性，對(duì)SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的抑制活性均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑(cisplatin)。

5 結(jié)論

含有3,5-二甲?；S基間苯三酚特征結(jié)構(gòu)單元的混源雜萜是從桃金娘科植物番石榴葉中發(fā)現(xiàn)的一類罕見結(jié)構(gòu)，這種特征結(jié)構(gòu)單元能夠與萜烯、黃酮雜合形成多種抗腫瘤活性顯著的新奇骨架。從天然產(chǎn)物化學(xué)研究角度出發(fā)，番石榴雜萜類次生代謝產(chǎn)物是一類不可多得、具有極高“創(chuàng)造系數(shù)”和顯著生物活性，值得深入研究的寶貴資源。本課題組前期已從越南產(chǎn)番石榴葉中分離得到5個(gè)具有抗腫瘤活性的雜萜類化合物guajadials B-F[9,10]，并在提出合理生源假說的基礎(chǔ)上，通過“萜烯-二甲?；g苯三酚-苯甲醛”三分子偶聯(lián)反應(yīng)，完成了對(duì)guajadial B的仿生合成[9]。為進(jìn)一步研究番石榴的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對(duì)我國(guó)云南產(chǎn)番石榴葉的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離，得到了13個(gè)化合物，包括5個(gè)該植物中特有的雜萜成分1～5。其中，化合物1為L(zhǎng)ee等[15]在合成番石榴雜萜guajadial 和psidial A時(shí)得到的異構(gòu)化副產(chǎn)物，為首次從天然產(chǎn)物中分離得到；化合物5對(duì)5種人體腫瘤細(xì)胞株顯示出較為明顯的抑制活性，且對(duì)SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的抑制活性均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑(cisplatin)。以上研究結(jié)果為番石榴葉在抗腫瘤方面的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。